Hvordan man tæller celler med en Microscope

Celler observeret på et dias placeret under et mikroskop tælles med et fælles laboratorieværktøj kendt som et hæmacytometer eller et celletællingskammer i forbindelse med et udelukkelsesfarvestof, der hedder Trypan Blue. Farvestoffet pletter døde celler blå, men kan ikke komme ind i levende celler, som vil fremstå som lyse, hvide kugler gennem mikroskopets okular. Forskere skal tælle celler for at placere det korrekte antal celler i et cellekulturmedium eller eksperimentelt reagens til kvantificering og analyse eller simpelthen for at forhindre, at celler overgrover.

Bestem typen af ​​hæmacytometer (f.eks. Neubauer) bliver brugt. Disse er dybest set tykke mikroskop dias indeholdende et centralt område ætset med tællegitter. Placer dette under mikroskopet indstillet til en lav forstørrelse (10-20X) og juster linsens fokus, indtil invidivale tælleregister er synlige.

Forbered en celleophæng. Brug enzymet trypsin til at opdele vævet i enkeltceller og derefter neutralisere trypsinet med serum. Vask og pellet cellerne og resuspender i medier eller saltvand. Eliminer celleklumper ved at pipetter forsigtigt op og ned. Hvis suspensionen forekommer overskyet, fortyndes dette yderligere med mere saltvand.

Brug Trypan Blue til at udelukke døde celler. Overfør 10-20 mikroliter cellesuspension i et sterilt rør og bland med det nøjagtigt samme volumen Trypan Blue farvestof ved pipettering forsigtigt. Dette fortynder cellesuspensionen 1: 2 i Trypan Blue.

Forbered hemaktyometeret. Tør med 70% ethanol, lufttørre og læg derefter en dæksel over tællegitterne. Placer 10 μl cellesuspension i \\ "drænet \\" øverst på hvert gitter, og lad det \\ "drain \\" trække det under dækslet. Gentag for dette andet tælleregister, indtil begge har et jævnt lag af celleophæng.

Tæl antallet af celler ved hjælp af manuel tæller. Levende celler afspejler lys og vises skinnende, hvidlig og sfærisk. Celler, der er blå, er døde eller beskadigede og bør ikke tælles, medmindre ikke-levedygtige celleantal er påkrævet. Gentag for alle 8 tællegitter, og tag derefter gennemsnittet. For eksempel, hvis 800 celler tælles i 8 gitter, så er gennemsnittet pr. Gitter 100 celler.

Beregn celletætheden i den oprindelige suspension. Anvend det gennemsnitlige antal celler til følgende formel: Cellekoncentration = Gennemsnitligt antal celler X 10.000 X fortyndingsfaktor (= 2, hvis fortynding er 1: 2) X volumen suspension (i milliliter, juster efter behov for mikroliter osv. ).

Rengør hæmacytometeret. Vask fra cellesuspensionen, tør hæmacytometeret ned med blegemiddel og /eller 70% isopropanol eller oversvømmelse med 70% ethanol. Lad tørre eller tørre tørre med en fnugfri klud og kassere alle uønskede cellesuspensioner i biohazardbeholdere.

Advarsel

Trypan Blue er en mutagen og pletter permanent, så sørg for at beskyttelsestøj og Handsker er slidt før de fortsætter.