Forskning forbedrer multipleks mutagenese for at øge eksperimentel effektivitet i plantegenomredigering

CRISPR/Cas9 er fortsat det mest kraftfulde værktøj til at generere mutationer i plantegenomer. At studere de forskellige kombinationer af mutationer har øget omfanget af eksperimentelle opsætninger betydeligt, hvilket nødvendiggør mere plads til at dyrke adskillige planter.

Forskere fra VIB-UGent Center for Plantesystembiologi har forbedret multipleks mutagenese, hvilket reducerer kompleksiteten og omkostningerne ved storstilede genomredigeringsprojekter. Deres resultater er blevet offentliggjort i The Plant Journal .

CRISPR/Cas-eksperimenter øges konstant i skala, ikke kun med hensyn til antallet af mutanter skabt gennem præcis genomredigering, men også med hensyn til antallet af gener, der kan muteres samtidigt. Laboratoriet af Thomas Jacobs fra VIB-UGent Center for Plantesystembiologi har udviklet skærme til systematisk at mutere titusinder, hundreder eller endda tusindvis af gener ad gangen.

Målet er at øge effektiviteten af ​​arvelige kimlinjemutationer og i sidste ende reducere kompleksiteten og omkostningerne ved storstilede genomiske redigeringsprojekter.

For at opnå dette fokuserede holdet på to nøgleaspekter af CRISPR/Cas9 vektordesign:promotoren til at drive Cas9-ekspression og de nukleare lokaliseringssignaler (NLS), der leder proteinet til kernen. Ved at genotype tusindvis af Arabidopsis-planter fandt de ud af, at brug af RPS5A-promotoren til at udtrykke Cas9 førte til den højeste mutationshastighed, og at flankering af Cas9-proteinet med bipartite NLS var den mest effektive konfiguration til at skabe kimlinjemutationer.

Kombination af disse to elementer resulterer i den højeste observerede multiplex-redigeringseffektivitet, hvor 99 % af planterne huser mindst én knockout-mutation og over 80 % med 4 til 7 mutationer.

"Dette repræsenterer et betydeligt fremskridt inden for plantegenetik og giver et pålideligt og effektivt værktøj til forskere, der fokuserer på kompleks genteknologi. Det, jeg finder særligt interessant, er effekten af ​​NLS. Jeg tør godt sige, at det havde en stærkere effekt end fremme ," sagde Dr. Thomas Jacobs, gruppeleder ved VIB-UGent Center for Plant Systems Biology

De optimeringer, der er opnået i undersøgelsen, reducerer kompleksiteten og omkostningerne ved storstilede genomredigeringsprojekter i plantevidenskab markant. For at sige det i tal:med deres tidligere vektor blev en CRISPR-skærm, der ledte efter alle dobbelte knockouts på kun 20 gener, anslået til at kræve en population på omkring 18.000 planter. Med de nye vektorer skulle det tage omkring 3.000 planter.

"Disse optimeringer vil være nyttige til at generere knockouts af højere orden i Arabidopsis' kimlinje og vil sandsynligvis også gælde for andre CRISPR-systemer," sagde Ward Develtere, Ph.D. elev og hovedforfatter af rapporten.

Flere oplysninger: Ward Develtere et al., Kontinuerlig forbedring af CRISPR-induceret multipleks mutagenese i Arabidopsis, The Plant Journal (2024). DOI:10.1111/tpj.16785

Journaloplysninger: The Plant Journal

Leveret af VIB (Flanders Institute for Biotechnology)