Hvordan bliver en human insulingener en del af plasmidet?

1. Isolering af det humane insulingen

* mRNA -ekstraktion: Humant insulin mRNA ekstraheres fra celler, der producerer insulin (beta -celler i bugspytkirtlen).

* omvendt transkription: MRNA omdannes til komplementært DNA (cDNA) ved anvendelse af omvendt transkriptase. Dette cDNA er en stabil kopi af insulingenet.

2. Ændring af genet (valgfrit)

* Optimering til bakterieudtryk: Insulingenet kan muligvis have brug for små modifikationer for at sikre, at det udtrykkes optimalt af bakterier. Dette kan involvere:

* Ændring af kodoner: Den genetiske kode kan ændres lidt for at matche de foretrukne kodoner, der bruges af bakterier.

* Tilføjelse af restriktionsenzymsteder: Dette muliggør præcis indsættelse i plasmidet.

3. Forberedelse af plasmidet

* Valg af plasmid: En passende plasmidvektor vælges. Dette er små, cirkulære DNA -molekyler, der kan replikere uafhængigt inde i bakterier. De har typisk:

* Replikationsoprindelse: Denne sekvens giver plasmidet mulighed for at replikere inden i bakteriecellen.

* Antibiotikaresistensgen: Dette gen giver mulighed for valg af bakterier, der bærer plasmidet.

* Multiple Cloning Site (MCS): Denne region indeholder en række begrænsningsenzymgenkendelsessteder, hvilket muliggør let indsættelse af insulingenet.

4. Skære plasmidet og indsætte genet

* begrænsningsenzymer: Plasmidet og insulingenet skæres under anvendelse af restriktionsenzymer, der genkender specifikke DNA -sekvenser. Dette skaber matchende "klistrede ender" på begge DNA -molekyler.

* ligering: Det udskårne plasmid og det modificerede insulingen blandes sammen med DNA -ligase. Dette enzym slutter sig til de klæbrige ender og indsætter effektivt insulingenet i plasmidet.

5. Transformering af bakterier

* Kompetente celler: Bakterier fremstilles "kompetente" til at optage DNA. Dette kan involvere behandling af dem med calciumchlorid eller andre metoder.

* Transformation: Plasmidet indeholdende insulingen indføres i de kompetente bakterieceller.

* valg: Bakterier, der med succes har taget plasmidet, vælges ved at udplade dem på et vækstmedium indeholdende det antibiotikum, som plasmidet giver modstand mod. Kun de bakterier, der har plasmidet, kan overleve.

6. Ekspression af insulin

* Produktion: De transformerede bakterier bærer nu det humane insulingen og udtrykker det og producerer humant insulinprotein.

* rensning: Insulinproteinet ekstraheres og oprenses fra bakteriecellerne.

Kortfattet:

Denne proces giver mulighed for storstilet produktion af humant insulin, en vigtig behandling af diabetes. Ved at kombinere kraften i genetisk teknik, bakterielle ekspressionssystemer og strenge oprensningsmetoder kan forskere producere sikkert og effektivt insulin for millioner af mennesker over hele verden.