TA-kloning:En hurtig, restriktionsfri PCR-produktsubkloningsteknik

Af Nitu Bansal | Opdateret 24. marts 2022

TA-kloning tilbyder en ligetil, begrænsningsfri tilgang til subkloning af PCR-produkter. Teknikken udnytter den komplementære parring af thymin og adenin, hvilket muliggør direkte ligering uden behov for restriktionsenzymer. PCR-amplifikation udføres typisk med Taq-polymerase, som tilføjer et enkelt 3'-adenin-overhæng til hver DNA-streng.

Metode

Ved TA-kloning indeholder en lineariseret vektor – kendt som en T-vektor – enkelte 3′‑T udhæng. PCR-produktet, der bærer 3′‑A udhæng, blandes med T-vektoren i et højt molært forhold. T4 DNA-ligase tilsættes derefter til blandingen, hvilket tillader de komplementære A-T-par at anneale og forsegles, hvilket resulterer i et rekombinant plasmid.

Fordele og ulemper

Fordele:

• Hurtig og enkel protokol – der kræves ingen restriktionsenzymer.
• Ideel til kloning af fragmenter, der mangler passende restriktionssteder.
• Høj ligeringseffektivitet ved brug af T-vektorer af høj kvalitet.

Ulemper:

• Kommercielle sæt kan være dyre, hvilket begrænser udbredt brug.
• Ikke-retningsbestemt kloning øger chancen for vending af insert-retningen.

TA-kloningssæt

Førende producenter leverer TA-kloningssæt, der er klar til brug, inklusive Invitrogen, QIAGEN og Premier Biosoft. Disse kits giver forudforberedte T-vektorer og optimerede ligeringsreagenser for at strømline arbejdsgangen.