Sådan beregnes cellekoncentrationen i suspensioner nøjagtigt

Tatomm/iStock/GettyImages

Bestemmelse af koncentrationen af celler i en væskeprøve er en rutinemæssig, men alligevel væsentlig opgave i kliniske og forskningslaboratorier. Nøjagtige celletællinger informerer læger om en patients immunstatus, hjælper med at diagnosticere infektioner og vejlede fertilitetsvurderinger. I forskning gør de det muligt for forskere at kvantificere bakterier, gær og andre mikroorganismer til økologiske undersøgelser eller industrielle processer. Den mest almindelige, pålidelige metode til celletælling er hæmocytometeret, et præcist tællekammer, der i vid udstrækning undervises i biologikurser og bruges i professionelle laboratorier over hele verden.

1. Fortynd prøven

Når en cellesuspension indeholder millioner af celler, bliver direkte tælling upraktisk, fordi celler overlapper hinanden og ikke kan skelnes. For at opnå en passende fortynding overføres 10 µL af den originale opløsning til et sterilt reagensglas, der indeholder 90 µL af et passende fortyndingsmiddel (f.eks. fosfatbufret saltvand eller dyrkningsmedium). Bland grundigt; dette skaber en ti-dobbelt fortynding (fortyndingsfaktor=10⁻¹). Mærk røret, og gentag proceduren, indtil prøven er fortyndet nok til nøjagtig tælling. Hver yderligere ti gange fortynding multiplicerer fortyndingsfaktoren med 10 (f.eks. giver en anden fortynding 10⁻², en tredje 10⁻³).

2. Tæl cellerne

Hæmocytometeret er et lille, klart kammer med et gitter ætset på dets bundoverflade. Dens dybde er typisk 0,1 mm, og gitteret er opdelt i store og små firkanter, hvis areal er henholdsvis 1 mm² og 0,04 mm². Pipetter en lille mængde af den fortyndede suspension ind i kammerets brønd. Kapillærvirkning spreder væsken hen over gitteret. Placer kammeret på et mikroskopbord og se det ved lav forstørrelse (×10–×40).

Vælg et praktisk mønster af firkanter - almindeligvis de fire hjørner og en central firkant - for at tælle mindst 100 celler. For store celler skal du bruge de større firkanter; for mindre celler, tæl de mindre firkanter. Registrer antallet af celler i hver valgt firkant.

3. Beregn koncentrationen af den fortyndede prøve

Hver stor firkant har et volumen på 0,1 mm³ (0,1 mm×1 mm²). Hvis du talte 103 celler på tværs af fem store firkanter, er det samlede talte volumen 0,5 mm³. Fordobling af dette volumen til at repræsentere hele 1 mm³ giver 206 celler. Fordi 1 ml er lig med 1 cm³ og indeholder 1.000 mm³, er koncentrationen i den fortyndede prøve:

• Celler pr. mm³ =206 celler ÷ 1 mm³ =206 celler/mm³
• Celler pr. ml =206 celler/mm³×1.000 =206.000 celler/mL

Formel:Volumen af optalt areal×antal kvadrater =samlet talt volumen
Celler ÷ samlet talt volumen =celler pr. mm³
celler pr. mm³×1.000 =celler pr. mL

4. Bestem den ufortyndede prøvekoncentration

Juster for den fortyndingsfaktor, der blev brugt under forberedelsen. For en fortyndingsfaktor på 10⁻² (dvs. 1:100) er den oprindelige prøvekoncentration:

• Celler pr. ml (fortyndet) ÷ fortyndingsfaktor =206.000 ÷ 0,01 =20.600.000 celler/mL

Således indeholdt den første ufortyndede suspension ca. 20,6 millioner celler pr. milliliter.