At forme lys lader 2-D-mikroskoper fange 4-D-data

Rice University-forskere har tilføjet en ny dimension til deres banebrydende teknik, der udvider mulighederne for standard laboratoriemikroskoper.

To år siden, Rice lab af kemiker Christy Landes introducerede super tidsmæssig opløsningsmikroskopi, en teknik, der gjorde det muligt for forskere at afbilde fluorescerende molekyler 20 gange hurtigere end traditionelle laboratoriekameraer normalt tillader. De har nu udviklet en generel metode til at lade et mikroskop fange 3-D rumlig information sammen med den fjerde dimension, molekylær bevægelse over tid.

Det her, de siger, vil hjælpe forskere, der studerer dynamiske processer med at se, hvor molekyler af interesse er placeret, og hvor hurtigt de bevæger sig - f.eks. i levende celler.

Rice-metoden til at udvide mulighederne for eksisterende wide-field fluorescensmikroskoper er beskrevet i holdets open-access papir i Optik Express .

Den beskriver oprettelsen af ​​brugerdefinerede fasemasker:gennemsigtige, roterende diske, der manipulerer lysets fase for at ændre formen på billedet, som er taget af mikroskopets kamera. Formen indeholder information om et molekyles 3D-position i rummet, og hvordan det opfører sig over tid inden for kameraets synsfelt.

En fasemaske gør, hvad der virker som en besvær, den slørede klat i et mikroskopbillede, ind i et aktiv. Forskere giver denne klat et navn - punktspredningsfunktion - og bruger den til at få detaljer om objekter under diffraktionsgrænsen, der er mindre end alle synlige lysmikroskoper er i stand til at se.

Det originale arbejde brugte en roterende fasemaske, der transformerede lys fra et enkelt fluorescerende molekyle til det, forskerne kaldte en roterende dobbelthelix. Det optagne billede dukkede op på kameraet som to lysende diske, som lapperne på en vægtstang. I det nye værk, de roterende vægtstænger lader dem ikke kun se, hvor molekyler var i det tredimensionelle rum, men gav også hvert molekyle et tidsstempel.

Hjertet i det nye værk ligger i algoritmer af hovedforfatteren og alumnen Wenxiao Wang i Rice, som er elektrisk og computeringeniør. Algoritmerne gør det praktisk at designe tilpassede fasemasker, der ændrer formen på punktspredningsfunktionen.

"Med den dobbelte helixfasemaske, tidsinformation og rumlig information var forbundet, " sagde medforfatter Chayan Dutta, en postdoc-forsker i Landes' laboratorium. "Lobernes rotation kunne udtrykke enten 3-D rum eller hurtig tidsinformation, og der var ingen måde at kende forskel på tid og rum."

Bedre fasemasker løser det problem, han sagde. "Det nye fasemaskedesign, som vi kalder en stræklapfasemaske, adskiller rum og tid, " sagde Dutta. "Når målene er i forskellige dybder, lapperne strækker sig længere fra hinanden eller kommer tættere på, og tidsinformationen er nu kodet kun i rotationen."

Tricket er at manipulere lyset ved den roterende fasemaske for at optimere mønsteret til forskellige dybder. Det opnås ved det brydningsmønster, der er programmeret ind i masken af ​​algoritmen. "Hvert lag er optimeret i algoritmen til forskellige detektionsdybder, " sagde kandidatstuderende og medforfatter Nicholas Moringo. "Hvor før, vi kunne se objekter i to dimensioner over tid, nu kan vi se alle tre rumlige dimensioner og hurtig tidsadfærd samtidigt."

"Wide-field fluorescensmikroskoper bruges på mange områder, især cellebiologi og medicinsk billeddannelse, " sagde Landes. "Vi er lige begyndt at demonstrere, hvordan manipulation af lysets fase i et mikroskop er en rimelig simpel måde at forbedre rum- og tidsopløsning sammenlignet med at udvikle nye fluorescerende tags eller udvikle nye hardwareforbedringer."

Et vigtigt resultat, der kunne have bred appel, hun sagde, er, at forskerne generaliserede fasemaskedesignet, så forskerne kan fremstille masker for at skabe stort set ethvert vilkårligt mønster. At demonstrere, gruppen designede og fremstillede en maske for at skabe en kompleks punktspredningsfunktion, der udtaler RICE i forskellige brænddybder. En video viser de spøgelsesagtige bogstaver vises og forsvinder, når mikroskopet bevæger sig til forskellige dybder over og under brændplanet.

En sådan fleksibilitet vil være nyttig til applikationer som at analysere processer inde i levende kræftceller, et projekt, som laboratoriet håber at forfølge snart med partnere i Texas Medical Center.

"Hvis du har en celle på en rude, du vil være i stand til at forstå, hvor objekter i cellen er i forhold til hinanden, og hvor hurtigt de bevæger sig, " sagde Moringo. "Kameraer er ikke hurtige nok til at fange alt, hvad der sker i en celle, men vores system kan."