Forskere øger følsomheden og hastigheden af ​​Raman-mikroskopiteknikken

Forskere har udviklet en etiketfri og ikke-invasiv Raman-spektroskopi-tilgang, der kan tage mikroskopiske billeder af biologiske prøver og identificere en bred vifte af biomolekyler med hidtil uset hastighed og følsomhed.

"Vores arbejde kan føre til en ikke-invasiv, etiketfri og brugervenlig enhed til klinisk brug," sagde leder af forskningsteamet Dario Polli fra Politecnico di Milano i Italien. "Dette innovative mikroskop, kombineret med deep learning-baserede algoritmer, kunne i sidste ende gøre det nemmere og hurtigere at diagnosticere kræft ved at tillade visualisering af de kemiske bestanddele af menneskelige væv og celler."

I tidsskriftet Optics Express , beskriver forskerne deres nye teknik, som er baseret på kohærent anti-stokes Raman scattering (CARS) mikroskopi. CARS-mikroskopi producerer billeder baseret på molekylers vibrationssignaturer ved at udnytte interaktionen mellem ultrakorte laserimpulser og biologiske prøver.

Den nye tilgang giver adgang til det svært-at-detektere område af vibrationsspektret kendt som fingeraftryksområdet, som spænder fra 400 til 1800 cm ⁻¹ . Selvom mange individuelle forbindelser kan identificeres ved hjælp af deres vibrationsfingeraftryk i denne region, har det en tendens til at producere svage signaler, som er svære at opdage.

"Almindelig anvendte teknikker i biomedicinske videnskaber kræver ofte farvning, hvilket ikke kun er besværligt, men også kan introducere strukturelle og kemiske ændringer, der kan føre til artefakter eller fejl i billeddannelse og databehandling," sagde Polli. "Fordi vores system kan skelne mellem mange forskellige kemiske arter i biologiske væv uden mærker, kan det være nyttigt til levende cellebilleddannelse og analyse af vævsbiopsier."

Lavere gentagelsesfrekvens, hurtigere billeddannelse

Dette nye arbejde er en del af CRIMSON-projektet, som har til formål at udvikle en nøglefærdig billedbehandlingsenhed, der bruger vibrationsspektroskopi til hurtig celle- og vævsklassificering. Projektets mål er at transformere undersøgelsen af ​​sygdommes cellulære oprindelse for at muliggøre nye tilgange, der kan fremme personlig terapi.

Som et vigtigt skridt mod dette mål udviklede forskerne et CARS-mikroskop baseret på en kommerciel laser, der producerer ultrakorte pulser med varigheder på cirka 270 femtosekunder i det nær-infrarøde bølgelængdeområde. De designede mikroskopisystemet til at bruge laserimpulser med en gentagelseshastighed på 2 MHz, hvilket er meget lavere end de 40 eller 80 MHz, der bruges af de fleste andre CARS-systemer.

Denne lavere gentagelseshastighed reducerer fototermisk skade på prøven, fordi den skaber en forsinkelse på 0,5 mikrosekunder mellem to på hinanden følgende impulser. Den producerer også en højere pulsenergi og spidsintensitet ved brændpunktet, hvilket genererer et stærkere CARS-signal og tillader en hurtigere optagelseshastighed.

"Den vigtigste fordel ved den lavere gentagelseshastighed er, at den gjorde det muligt for os at generere bredbånds, rødforskudte Stokes-impulser, der dækker hele fingeraftryksvibrationsområdet ved at bruge superkontinuumgenerering i hvidt lys i en bulkkrystal," sagde Federico Vernuccio, doktorand. ved Politecnico di Milano og førsteforfatter af undersøgelsen. "Sammenlignet med andre metoder er denne tilgang teknisk enklere, mere kompakt og robust."

Brug af et spektralområde, der er rødforskudt sammenlignet med standardopsætninger, betyder, at højere laserintensiteter kan bruges, før fotoskader opstår. Forskerne udviklede også nye algoritmer, der kombinerer standard numeriske beregningsmetoder med kunstig intelligens. Disse algoritmer henter mere information fra de indhentede data og omdanner dem til billeder, der gør det let at skelne mellem forskellige kemiske arter.

"Takket være vores forbedringer leverer CARS-systemet billeder i høj kvalitet med en avanceret optagelseshastighed," sagde Vernuccio. "Vores system har en pixel-dvæletid på mindre end 1 millisekund uden at kompromittere prøveintegriteten. Denne hastighed er begrænset af spektrometerets opdateringshastighed."

Højhastighedsfølsomhed

For at teste deres system brugte forskerne referenceprøver til at sammenligne spektre hentet med det nye mikroskop med dem, der blev erhvervet ved hjælp af en state-of-the-art, selvom langsommere, vibrationsspektroskopiteknik. De to metoder viste fremragende overensstemmelse og demonstrerede, at det nye system kunne levere spektre ved meget høje hastigheder med god spektral opløsning og kemisk specificitet.

Forskerne bestemte derefter detektionsgrænsen for deres system ved at erhverve CARS-spektre af et sæt dimethylsulfoxidopløsninger med forskellige koncentrationer. Systemet var i stand til at måle kemisk koncentration med den hidtil usete følsomhed på 14,1 mmol/liter, omkring dobbelt så stor følsomhed som andre CARS-systemer, der arbejder i fingeraftryksområdet.

De viste også systemets evne til at skelne og rumligt lokalisere forskellige gennemsigtige plastikperler i mikronstørrelse baseret på deres vibrationssignatur og tog målinger fra biologiske væv for at demonstrere, at teknikken virker på biologiske prøver uden at forårsage skade.

"Vores CARS-mikroskop tillader etiketfri billeddannelse med kemisk specificitet ved højere hastigheder, hvilket gør Raman-billeddannelse af levende celler mere mulig," sagde Polli. "Dette kunne gøre det muligt for vores system at blive brugt til at analysere interaktioner mellem kræftceller og immunceller eller til at karakterisere, hvordan kemoterapi påvirker celler, for eksempel."

Forskerne arbejder nu på at forbedre deres system ved at skabe et endnu bredere bølgelængdeområde af Stokes-impulser gennem generering af superkontinuum med hvidt lys. Dette ville forbedre både billeddannelseshastigheden og antallet af påviselige kemiske analytter. De arbejder også hen imod kommercialisering ved at udvikle brugervenlig software, kompakte optiske kilder og design til en kommerciel prototype og detektionssystem. + Udforsk yderligere

THz-fingeraftryksvibrationsspektroskopi ved en ultrahurtig spektralhastighed