Et nær-infrarødt fluorescerende farvestof til langsigtet biobilleddannelse

En gruppe kemikere ved Institute of Transformative Bio-Molecules (ITbM), Nagoya Universitet, har udviklet et nyt nær infrarødt (NIR) emitterende fotostabilt fluorescerende farvestof PREX 710 (fotoresistent xanthenfarvestof, der kan ophidses ved 710 nanometer) for at have anvendelser, der spænder fra langtidsbillede af enkeltmolekyler til in vivo dyb billeddannelse, ifølge en undersøgelse rapporteret i tidsskriftet Angewandte Chemie International Edition .

PREX 710 har en molekylær struktur bestående af en phosphinoxiddel (P=O) i stedet for oxygen i dens sammensmeltede tricykliske xanthenkerne, og 2 methoxy (OMe) grupper på den perifere aromatiske ring, som gør det muligt for farvestoffet at absorbere og udsende i NIR-regionen, og tegner sig for dets høje kemiske og fotostabilitet, henholdsvis. Ud over, PREX 710 NHS -esteren kan være kemisk forbundet med biomolekyler inklusive proteiner, sukkerarter, og små organiske ligander, som kan føre til observationer af forskellige strukturer og begivenheder i levende celler.

Sammen med forskerne fra RIKEN og Ehime University, teamet har fundet ud af, at PREX 710 kunne bruges til fluorescerende billeddannelse med et enkelt molekyle under fysiologiske forhold. Den høje fotostabilitet af PREX 710 muliggør gentagen billeddannelse, og dets specifikke lysabsorptions-/emissionsegenskaber i NIR-regionen, tillader flerfarvet billeddannelse med dets anvendelse med andre fluorescerende farvestoffer. I øvrigt, ved at forbinde PREX 710 NHS -ester med et polysaccharid (dextran), teamet lykkedes med 3D-dyb in vivo-billeddannelse af blodkar i musens hjerner. Dette blev muliggjort af den høje kemiske stabilitet af PREX 710 i blodbanen, samt ved brug af NIR-stråling til at se dybt inde i vævene. Den høje fotostabilitet, vandopløselighed og kemisk stabilitet, sammen med dens lave cytotoksicitet, og brug af NIR-stråling gør PREX 710 til et kraftfuldt værktøj til at visualisere molekylære processer og strukturer i lange varigheder uden fotoblegning inde i levende organismer.

Fluorescensbilleddannelse er en teknik, hvor et specifikt protein eller celleorganel er mærket med en fluorescerende probe og bruges til at visualisere processer og strukturer af organismer under et fluorescerende mikroskop. Selvom mange fluorescerende mærkningsmidler, såsom fluorescerende proteiner og små fluorescerende organiske molekyler er blevet udviklet indtil nu, de fleste af dem bruger stråling i det synlige område. Ulemperne ved at bruge synligt lys som blåt eller grønt lys skyldes dets høje energi, som kan forårsage skade på levende prøver, når de udsættes i længere perioder. Ud over, når prøverne exciteres med synligt lys, autofluorescens fra prøverne selv har en tendens til at forstyrre signalerne fra de fluorescerende sonder. Det er også kendt, at biomolekyler såsom hæmoglobin har tendens til at absorbere synligt lys, så lyset ikke når dybt inde i organismerne, som har gjort er svært at visualisere levende blodkar og organer.

Disse problemer, der opstår ved billeddannelse med synligt lys, kan overvindes ved hjælp af NIR-stråling, som har en længere bølgelængde, dermed lavere energi, sammenlignet med synligt lys. Ikke desto mindre, mange af de hidtil udviklede NIR-farvestoffer er baseret på cyaninfarvestoffer, som består af polymethinkæder (methin (CH) grupper forbundet med skiftende enkelt- og dobbeltbindinger), der har nitrogenholdige heterocykliske kredsløb knyttet til hver ende af kæden. Størstedelen af ​​cyaninfarvestofferne lider af lav kemisk og fotostabilitet, hvilket gør det vanskeligt at få langtids bioimaging med disse farvestoffer på grund af fotoblegning over tid. Selvom anti-fading midler kan tilsættes for at forhindre fotoblegning, de er muligvis ikke anvendelige i levende celleforsøg.

"Yamaguchi -gruppen har været interesseret i at lave fotostabile farvestoffer til bioimaging, der absorberer og udsender i forskellige bølgelængder, " siger Dr. Masayasu Taki, en lektor i professor Shigehiro Yamaguchis gruppe ved ITbM, og en af ​​lederne af denne undersøgelse. "Det er kendt, at excitations- og emissionsbølgelængderne af farvestoffer øges med en stigning i konjugerede dobbeltbindinger i dens struktur, men flere ringe gør syntesen kompliceret og fører også til lav vandopløselighed, som ikke er ideel til billeddannelse under fysiologiske forhold. Vi besluttede derfor at syntetisere forskellige farvestoffer ved at ændre grundstofferne på xanthenringen fra ilt til fosfor."

"Dr. Marek Grzybowski, en postdoktor i vores gruppe, har arbejdet på dette projekt, og har udtænkt synteserne af mange af de rhodamin-baserede fluorescerende farvestoffer for nylig udviklet i vores gruppe, " beskriver Taki.

Under deres studier, gruppen fandt også, at et af derivaterne af PREX 710 var modtageligt for angreb mod en reduceret form for glutathion (GSH), som er et tripeptid, der fungerer som en antioxidant i celler. Selvom affarvning af farvestoffer med GSH generelt anses for at være en ulempe ved fluorescerende levende billeddannelse, gruppen regnede med, at dette farvestof kunne tjene som en lovende NIR-probe til at overvåge GSH-niveauet i levende celler og væv.

"Efter syntetisering og test af forskellige xanthenderivater, vi fandt PREX 710, som udviste enestående kemisk og fotostabilitet, og viste sig således at være en praktisk NIR-emissiv fluorofor, som i sig selv er membrangennemtrængelig og hovedsageligt lokaliseres i mitokondrierne af levende HeLa-celler, " forklarer Taki. "Vi var virkelig glade for at se, at ved at bruge PREX 710, vi kunne visualisere levende cellekomponenter i mange minutter sammenlignet med kun et par sekunder, der kunne opnås med konventionelle farvestoffer."

I samarbejde med Dr. Yasushi Okada, en teamleder ved RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research, teamet fandt PREX 710 til at være anvendelig til fluorescerende billeddannelse med et enkelt molekyle, en teknik, der er kendt for at kræve kraftig lysstråling. Deres undersøgelser viser, at under de samme eksperimentelle forhold, 80 % af enkeltmolekylets fluorescerende signaler fra PREX 710 kunne detekteres i 2 minutter, hvorimod halvdelen af ​​signalerne forsvandt inden for 20 sekunder med Alexa Fluor 647 (cyaninfarve). Forsøgene viser, at PREX 710 tydeligt kan visualisere hvert enkelt molekyle i længere perioder uden nogen fotoblegning i fravær af anti-fading midler.

Ud over, teamet var i stand til at gøre brug af PREX 710 i flerfarvet billeddannelse af levende HeLa -celler. Da NIR-excitations- og emissionsegenskaberne af PREX 710 adskiller sig fra synligt lys fluorescerende farvestoffer, spektral krydstale kan undgås for at visualisere cellekomponenter hver farvet med forskellige farvestoffer. For eksempel, flerfarvebilleddannelse af levende HeLa-celler var mulig ved farvning af cellemembranen, kerne og mitokondrier med kommercielt tilgængelige fluorescerende farvestoffer, såsom DiI og SiR-DNA, sammen med PREX 710, henholdsvis.

Den praktiske anvendelighed af PREX 710 blev også demonstreret ved at anvende sonden til in vivo dyb billeddannelse, som blev udført i samarbejde med Dr. Takeshi Imamura og Ryosuke Kawakami fra Ehime University. Ved hjælp af biokonjugeringsstedet i PREX 710, dextran, et polysaccharid sammensat af glukosemolekyler, blev fluorescerende mærket og injiceret i blodbanen via musehalevenen. 3-D-billedet af blodkar i musehjerne kunne konstrueres på grund af den høje lysstyrke af PREX 710 i NIR-regionen, der muliggør optagelse af fluorescenssignalerne i dybt væv.

"Vi var glade for at demonstrere, at PREX 710 og dens derivater er nyttige værktøjer til undersøgelse af levende organismers dynamik, væv, celler, og molekyler, " siger Taki. "Vi arbejder i øjeblikket på at udvikle andre NIR-fluorescensprober, der kan bruges til farvning af specifikke proteiner samt til at undersøge levende strukturer og processer mere i dybden. Vi håber, at dette vil føre til visualisering og belysning af forskellige fænomener i levende systemer, herunder medicinske symptomer, " han siger.