Ny metode opdager hurtigt spormængder af små molekyle forbindelser

Russiske forskere fra Prokhorov General Physics Institute of the Russian Academy of Sciences (GPI RAS) og Moskva Institute of Physics and Technology (MIPT) har udviklet verdens første ultrafølsomme metode til hurtig detektion af små molekyler. Denne metode registrerer spormængder af toksiner, hormoner, vitaminer og andre biologisk aktive molekyler, der er vigtige for sundheds- og fødevaresikkerhedsovervågning, blandt andre mulige anvendelser. Undersøgelsen er offentliggjort i novemberudgaven af Analytica Chimica Acta .

Den nye lateral flow-analyse er afhængig af magnetiske etiketter og tager mindre end 30 minutter. Det er 100 gange mere følsomt end det enzym-forbundne immunosorbent assay, eller ELISA, bruges til konventionelle laboratorietests. Forfatterne demonstrerede effektiviteten af ​​den nye tilgang på en modelanalyse, der måler thyroxin i humant blodserum. Thyroxin er et af de vigtigste hormoner, der produceres af skjoldbruskkirtlen og er nyttigt til overvågning af dets funktion. Analyseproceduren er overkommelig og enkel nok til at blive udført på plejestedet, lige efter blodprøvetagningen.

Grunden til, at det er nødvendigt at påvise små molekyleforbindelser med høj følsomhed, er, at de ofte har en stærk effekt på kroppen selv i små koncentrationer. I øjeblikket anses ELISA for at være guldstandarden til måling af koncentrationen af ​​små molekyler. Imidlertid, denne metode kræver tilstrækkeligt udstyrede laboratorier med højt kvalificeret personale til implementeringen. Følsomheden af ​​skjoldbruskkirtelhormondetektion kan øges via radioimmunoassays med radioaktive mærker, der har korte halveringstider på trods af deres betydelige begrænsninger og er potentielt farlige. Andre konventionelle analyser kræver lang prøveforberedelse og specialiseret udstyr.

lateral flow assay (LFA), bredt kendt for sin anvendelse i graviditetstests, repræsenterer et tiltalende alternativ. Sammenlignet med ELISA, det er mindre omstændeligt og teknisk komplekst. Imidlertid, i mange lande, det har kun myndighedsgodkendelse til at opnå tærskelresultater og kun for de tilfælde, hvor høj følsomhed ikke er afgørende. Det er derfor et fremmest mål inden for medicinsk diagnostik at udvikle en metode til påvisning af små molekyler, der vil være hurtig, følsom, og enkel.

I undersøgelsen rapporteret i denne historie, et fælles forskerhold fra GPI RAS og MIPT har udviklet et assaykit, der bruger en modificeret LFA med magnetiske nanomærker og bifunktionelle ligander. For at teste det nye systems kapacitet og begrænsninger, forfatterne valgte at påvise thyroxin, det vigtigste skjoldbruskkirtelhormon, som model. Derudover gav det deres forskning klinisk betydning.

Layoutet af den nye magnetiske immunoassay adskiller sig fra den konventionelle LFA i flere henseender (se figur 1). En patients blodserum, som er testet for fri thyroxin, suppleres samtidigt med magnetisk nanopartikel-mærkede antistoffer og med en bifunktionel thyroxinligand. Denne bifunktionelle ligand er en thyroxin kovalent bundet til biotin via en "bro", der forbinder de to molekyler, men også adskiller dem fra hinanden. Antistofferne på magnetiske nanopartikler kan således binde både til thyroxin fra blodserumet og til den bifunktionelle ligand. Efter et vist tidsrum, nok til at molekylerne i opløsningen binder sig til hinanden, blandingen afsættes på en membran. Partikler bundet til den bifunktionelle ligand fanges på testlinjen af ​​streptavidin, et protein, der har en ekstraordinær høj affinitet for biotin. For at hente analyseresultaterne, forskerne brugte originalt elektronisk udstyr, som anvender den ultrafølsomme magnetiske partikelkvantificeringsmetode, eller MPQ. Det involverer ikke-lineær partikelremagnetisering ved et vekslende magnetfelt ved to frekvenser og en efterfølgende detektering af den induktive respons ved kombinatoriske frekvenser. Sammen med nøjagtigheden af ​​MPQ-metoden, den høje affinitet af den bifunktionelle ligand mod teststrimlen sikrer en hidtil uset følsomhed af assayet, der når en detektionsgrænse på omkring 1 million molekyler af hormonet pr. milliliter (16 femtogram!) med et dynamisk område på tre ordener.

Petr Nikitin, Ph.D., der ledede forskerholdet, delte flere detaljer om undersøgelsen:"Vores metoder til at måle koncentrationen af ​​små molekyle forbindelser udføres via universelle immunokromatografiske strimler med streptavidin på detektionslinjen. Så, de er nemme at kopiere og skalere op. For at udvikle tests for andre analytter ville vi kræve standard antistoffer og specielle bifunktionelle ligander, hvis syntese for små molekyler er udfordrende."

"Heldigvis, vores værktøjssæt indeholder originale interferometriske teknikker og udstyr, som vi udviklede tidligere, som muliggør realtidsdetektion af molekylær interaktionsdynamik, " forklarede Petr Nikitin, en 1979 MIPT kandidat og leder af et laboratorium ved GPI RAS. "Vi brugte dette udstyr til at identificere de optimale immunreaktanter og de bifunktionelle thyroxin-biotin-ligander, som i sagens natur er fordelt, 'brokoblet' struktur gør begge små molekyler tilgængelige for effektiv interaktion med begge store molekyler – nemlig, med det detekterende antistof og streptavidin. Det sparede os for meget tid til testudvikling og bidrog i høj grad til denne forsknings succes."

Bladets hovedforfatter, Alexey Orlov, Ph.D., en forsker ved GPI RAS og MIPT's Nanobiotechnology Lab, tilføjet:"Vi bruger magnetiske partikler som nanomærker af immunokemiske reaktioner. En bærbar enhed detekterer disse partikler kvantitativt med rekordhøj præcision fra hele volumen af ​​3-D reaktionszonen på en teststrimmel, snarere end fra overfladen af ​​en membran, som det sker i tilfælde af optiske etiketter. Dette er en af ​​de faktorer, der sikrer enkelheden af ​​vores ultralavkoncentrationsmålinger af små molekyler i komplekse medier. Som resultat, Så godt som enhver er udstyret til at udføre unikt følsomme analyser uden omfattende prøveforberedelse."

"Det nye assay er en point-of-care testteknik, hvis egenskaber betydeligt overgår de eksisterende systemer til laboratoriediagnostik, " sagde Sergey Znoyko, Ph.D., avisens første forfatter. "I fremtiden, ved at udvide rækken af ​​biologiske molekyler, der kan påvises på denne måde, vi ville være i stand til at udføre en multiparameteranalyse af komplekse medier såsom blod, der ville være meget billigere end dets nuværende analoger."

"Denne tilgang er enkel, overkommelig, og kan tilpasses til påvisning af andre små molekyler, " sagde MIPT kandidatstuderende Natalia Guteneva, der var medforfatter til undersøgelsen. "Vi håber, at det ville blive brugt aktivt til at søge efter nye sygdomsmarkører, i medicinsk diagnostik, økologisk overvågning, fødevaresikkerhedskontrol, biosikkerhed, og andre steder."