3-D dyrkning af hepatocytter på en lever-på-en-chip-enhed

Lever-på-en-chip cellekulturenheder er attraktive biomimetiske modeller i lægemiddelopdagelse, toksikologi og vævsteknisk forskning. For at opretholde specifikke levercellefunktioner på en chip i laboratoriet, passende celletyper og dyrkningsbetingelser skal være opfyldt, som omfatter 3D-celleorientering og en konsekvent forsyning af næringsstoffer og ilt. Sammenlignet med konventionelle 2D-cellekulturteknikker, organ-på-en-chip-enheder tilbyder alsidighed og effektiv biomimik velegnet til avancerede anvendelser inden for lægemiddelopdagelse og medicin.

I en nylig undersøgelse offentliggjort på Biofremstilling , Jonas Christoffersson og kolleger demonstrerede, hvordan hydrogeler, der efterligner den ekstracellulære matrix, kan understøtte funktionaliteten og levedygtigheden af ​​hepatocytter i en perfunderet lever-på-en-chip-enhed. De tværfaglige forskere i afdelingen for bioteknologi og molekylær fysik konstruerede et hydrogelsystem baseret på hyaluronan og poly(ethylenglycol) (HA-PEG) polymerer. De udviklede hydrogelerne ved hjælp af klikkemi. For at aktivere processen, forskerne gennemførte en biorthogonal reaktion (kemi, der forekommer i levende systemer uden indblanding af native biokemiske reaktioner) mellem en cyclooctyndel og alkynazid-mærket reaktionspartner, kendt som stamme-promoveret alkynazid cycloaddition (SPAAC).

De nye hydrogelmaterialer blev konstrueret og karakteriseret i sammenligning med eksisterende agarose- og alginathydrogeler for cellekompatibilitet (cytokompatibilitet). Til biofunktionaliseringsundersøgelser, forskerne brugte humane inducerede-pluripotente stamcelle-afledte hepatocytter (hiPS-HEP'er). For at forbedre overfladecytokompatibiliteten af ​​biomaterialet, HA-PEG-hydrogeler blev ændret med azid-modificerede celleadhæsionsmotiver for at lette effektive cellemateriale-vedhæftninger. I det overfladefunktionaliserede biomateriale, hepatocytstamcellerne migrerede og voksede i 3D-retninger, med øget levedygtighed. Forskerne observerede højere albuminproduktion på det nye materiale (karakteristisk leverprotein), sammenlignet med celler dyrket på andre hydrogeler. Den fleksible, SPAAC tværbundet hydrogelsystem med perfunderet 3D-cellekultur af hiPS-HEP'er er et lovende materiale til at optimere lever-på-en-chip-enheder.

Miniaturiserede bioreaktorer kendt som 'organ-på-chips', er for nylig dukket op som alternative cellekulturmodeller, der bedre efterligner det in vivo biologiske mikromiljø i laboratoriet. Leveren er en model af særlig interesse i medicinsk forskning på grund af lægemiddelhepatotoksicitet observeret i alle faser af klinisk lægemiddeludvikling. Tidligere publikationer beskriver brugen af ​​organ-on-chips til at forudsige resultatet af et lægemiddels indvirkning i kliniske forsøg og evaluere lægemiddelinteraktioner med hepatocytter i laboratoriet.

På grund af deres bredere vedtagelse i akademiske og industrielle omgivelser, bioreaktorerne kræver optimerede materialer og betingelser for fremstilling med høj kapacitet. Betingelser omfatter udskiftning af det almindelige prototypemateriale polydimethylsiloxan (PDMS), integration af inducerede pluripotente stamceller (iPSC)-afledte celler på et blødt biomateriale, der letter deres vækst og minimerer det store dødvolumen forårsaget af mikrofluidiske reservoirer og slanger fra organ-on-chips-enheder.

Det nye biomateriale fremstillet i undersøgelsen indeholdt to hovedbestanddele tværbundet via SPAAC; en cykloocyt-modificeret hyaluronan (HA-BCN) og en multiarmet azid-modificeret PEG [p(N) ₃ ) ₈ ]. BCN reagerede med azider (N ₃ ) på den 8-armede PEG-polymer med afsluttende N ₃ -dele til at danne en stabil 1, 2, 3-triazol. Christoffersson et al. fuldførte kemiske reaktioner under fysiologiske betingelser for at danne hydrogelerne med justerbare viskoelastiske egenskaber. Tværbindingsstrategien var ideel til at fremstille hydrogeler til 3D-cellekultur; da cellerne kunne indkapsles i biomaterialet uden at kompromittere deres levedygtighed og var egnede til brug i mikrofluidiske enheder. Forskerne brugte overskydende SPAAC-dele på det nye biomateriale til at vedhæfte forskellige ligander inklusive RGD-peptider for at fremme interaktioner ved celle-materiale-grænsefladen.

Derefter, forskerne varierede sammensætningen af ​​de to hovedbestanddele for at forstå de resulterende viskoelastiske egenskaber, såsom lagringsmodulet (G') og tabsmodulet (G") af hydrogelerne via oscillerende rheologi (teknik til at måle den viskoelastiske opførsel af bløde materialer). De kontrollerede geldannelseskinetikken af ​​den nye hydrogel ved stigende temperaturer. Geleringskinetik af det nye biomateriale var langsomt nok til homogen cellefordeling, men hurtigt nok til at forhindre cellesedimentering. Evnen til at kontrollere geldannelseskinetik gjorde det muligt for forskerne at overveje en række biofremstillingsstrategier (f.eks. bioprint) og hydrogelsamling inden for de mikrofluidiske systemer til organ-på- chip applikationer.

Christoffersson et al. derefter sammenlignede HA-PEG hydrogelerne med de veletablerede 3D cellekultur stilladser - agarose og alginat hydrogeler. For at bestemme de endelige viskoelastiske egenskaber egnet til 3D-cellekultureksperimenter, de brugte oscillerende rheologi til at undersøge de forskellige polymerkoncentrationer. Forskerne analyserede sammensætningen af ​​de færdige materialer ved hjælp af scanning elektronmikroskopi (SEM) billeder.

Lever-på-en-chip design og opsætning skulle opfylde to nøglekriterier i undersøgelsen:

1. Tillad perfusion (passage af væske) af cellekulturmedium hen over hydrogeloverfladen for stabil udveksling af næringsmedier, til og fra de indkapslede hepatocytter.

2. Tillad prøveudtagning af det perfunderede medium til eksperimentel analyse under igangværende cellekultur, uden at påvirke hepatocytterne og hydrogelen.

For at opfylde disse kriterier, forskerne brugte en kommerciel 3D -cellekulturanordning (μ -Slide III 3D Perfusion IbiTreat) indeholdende to på hinanden følgende kamre (2 x 30 µL) i tre parallelle arrays - hver forbundet til mediereservoirer for at perfundere væske. For effektiv perfusion, de monterede enheden på et automatisk gyngebord ved at vende perfusatretningen hen over de hydrogelholdige kamre. Den eksperimentelle opsætning tillod perfusion gennem enheden, opfylder de første kriterier. For at opfylde det andet kriterium, de lokaliserede vægge ved siden af ​​hydrogelkamrene gjorde det muligt for forskerne at prøve perfusatet uden at forstyrre hydrogelen eller cellebestanddelene.

Forskerne undersøgte først biofunktionalisering af lever-på-en-chip-enheder i undersøgelsen med HEPG2-celler (levercarcinomcellelinje) indkapslet i hydrogeler, efter 3, 7 og 9 dages cellekultur. De sammenlignede cellemorfologien, levedygtighed og funktionalitet med agarose- og alginat -hydrogeler. Undersøgelsen omfattede levende/døde assays for at bekræfte cellelevedygtighed og yderligere bekræftet HepG2-funktionalitet ved at detektere albumin- og urinstofsekretioner i supernatanten af ​​cellekulturen.

For forbedret cellefunktionalitet (overfladefastgørelse og mobilitet på materialer), forskerne podede celleadhæsionsmotiver såsom lineære eller cykliske RGD-peptider (lineær linRGD eller cyklisk cRGD) på hydrogelerne. I dette tilfælde, hiPS-HEP-celler (hepatocytstamceller) blev dyrket på tværs af forskellige hydrogel-sammensætninger i 13 dage for at undersøge morfologi og levedygtighed (levende/død farvning) efter celle-materiale-interaktioner. Forskerne brugte seks forskellige hydrogelbaserede biomaterialeoverflader i eksperimenterne, herunder; 2D (HEP coat), Agarose, Alginat, HA-PEG, HA-PEG (linRGD) og HA-PEG (cRGD).

HiPS-HEP-cellerne indkapslet og dyrket i den modificerede hydrogel voksede inden for 2D og ægte 3D-konstruktioner. For at teste funktionaliteten af ​​de dyrkede hiPS-HEP-celler (stamceller), forskerne kvantificerede deres albumin- og urinstofudskillelse. Resultaterne viste, at kun supernatanterne af stamceller dyrket i 2D-overflader og i nærvær af cRGD-motivet udskilte hydrogeler albumin.

Baseret på resultaterne, forskerne tilskrev den højere albumin-mængde på 2D HEP-belægningen til hastigheden af ​​albumin-diffusion i hydrogeler; overførsel på tværs af 2D-belægning er hurtigere end 3D. Den højere koncentration af albumin med cRGD-motiv bundne hydrogeler, korreleret med den øgede cellevækst og levedygtighed observeret på de cRGD-bundne biomaterialeoverflader. Som resultat, forskerne har til hensigt at bruge cykliske former for RGD-peptid til at hjælpe med hepatocytstamcellekultur på hydrogeler, der er forberedt til lever-på-en-chip-enheder i fremtiden.

På denne måde undersøgelsen detaljerede fordelene ved at bruge hyaluronan-PEG-baseret hydrogel modificeret med RGD-peptider til 3D-kulturer af hepatocytter (cirka 13 dage) i en lever-på-en-chip-opsætning. Som benchmarks for undersøgelsen, Christofferfsson og kolleger brugte de almindeligt tilgængelige alginat- og agarosehydrogeler. I fremtiden, forskerne vil optimere de viskoelastiske egenskaber og koncentrationen af ​​celleadhæsionsmotiver på HA-PEG hydrogelsystemet til biomimetisk cytokompatibilitet. The optimized hydrogel system can be combined with the device setup to facilitate physiologically relevant liver-on-a-chip platforms for clinical research in drug toxicology, drug discovery and regenerative medicine.

© 2019 Science X Network