Let kopiering:En universel isoterm DNA -amplifikationsmetode

Uanset om man afslører en gerningsmand med DNA -bevis, diagnosticering af et patogen, klassificering af en paleontologisk opdagelse, eller bestemme faderskab, dobbeltarbejde af nukleinsyrer (amplifikation) er uundværlig. I journalen Angewandte Chemie , forskere har nu introduceret en ny, meget simpelt, alligevel meget følsom og pålidelig metode, der undgår de sædvanlige opvarmnings- og køletrin, samt komplicerede instrumenter. Reagenserne kan frysetørres, tillader denne universelle metode at blive brugt uden for laboratoriet.

Den mest almindeligt anvendte amplifikationsmetode er polymerasekædereaktionen (PCR), som er baseret på gentagelse af flere termiske cyklusser i specielle instrumenter, der har et stort behov for strøm. Det er svært at udføre uden for et laboratorium, ved en patients seng eller et fjerntliggende sted, for eksempel. Alternative metoder uden termiske cyklusser er ofte komplicerede eller ikke følsomme nok, kræver dyre reagenser, eller er ikke generelt anvendelige.

Forskere, der arbejder med Bin-Cheng Yin og Bang-Ce Ye ved East China University of Science &Technology, Shanghai, Kina, har nu udviklet en ny, billig metode:Kaldes Cas9n-baseret amplifikationsreaktion (Cas9nAR), den består af et enkelt trin i homogen opløsning, og finder sted ved en konstant temperatur på 37 ° C.

I denne tilgang bruger forskerne komponenter fra bakteriernes "immunsystem". Når bakterier er inficeret af en virus, for eksempel, de skærer det fremmede genetiske materiale i små bidder og introducerer dem i bestemte områder af deres eget genom. I tilfælde af en efterfølgende infektion, bakteriens RNA -tråde "genkender" disse sekvenser og dirigerer en særlig "genetisk saks" for at skære det fremmede DNA op. Disse værktøjer er også blevet anvendt i moderne genteknik.

Yin, Ye, og deres medarbejdere har ændret den genetiske sakse kendt som Cas9, så den ikke længere skærer fuldstændigt gennem DNA. I stedet, den skærer kun gennem en streng, indførelse af et "nick". Denne type enzym kaldes en "nickase". Ligesom i bakteriesystemet, Cas9 nickase binder til en RNA -streng, som bestemmer placeringen af ​​nick. Dette RNA kan fremstilles, så det genkender en DNA -sekvens, der er karakteristisk for et patogen, for eksempel. Cas9 -nickasen hakker derefter det umiddelbart tilstødende DNA.

For den nye teknik, forskerne producerede to forskellige Cas9 nickase RNA -komplekser, som nick DNA'et to forskellige steder. En polymerase, der almindeligvis anvendes i PCR (exo (?) Klenow -polymerase), supplerer snitstrengen, der starter ved det første nick, frigør den gamle streng, stykke for stykke, indtil den når det andet nick. Det nyligt afsluttede DNA bliver gentagne gange nicket og suppleret af nickase -komplekset. De korte enkelte tråde, denne proces frigiver, bliver udgangspunktet for yderligere forstærkning i en anden cyklus. Ud over nickasekomplekset og polymerasen, de eneste nødvendige ting er to egnede primere som udgangspunkt for kopierne.

Test med et fragment af bakterielt genomisk DNA viste, at målsekvensen nøjagtigt blev genkendt og amplificeret. I et volumen på 20 pi, det var muligt at påvise et enkelt molekyle. Forskelle mellem et enkelt nukleotid i et gen kunne påvises med høj specificitet.