En ny proteinspin-mærkningsteknik

Site-directed spin labeling (SDSL) brugt i kombination med elektron paramagnetisk resonans (EPR) spektroskopi har været en afprøvet og pålidelig teknik til at belyse strukturen, funktion og dynamik af proteiner og proteinkomplekser. Nitroxid-baserede spin-etiketter er blandt de mest populære og bedst etablerede, fordi de er små, ikke-forstyrrende og udviser fremragende spektroskopiske egenskaber. "Ideelle spin-mærkningsprocedurer udviser høje reaktionshastigheder og selektivitet, " forklarer professor Malte Drescher, Professor i spektroskopi af komplekse systemer ved universitetet i Konstanz's afdeling for kemi og hovedforfatter på undersøgelsen sammen med professor Valentin Wittmann, som har specialiseret sig i organisk syntese.

"Det kan være et problem at opnå høj reaktivitet og høj selektivitet på samme tid, " fortsætter Drescher. "Konventionelle spin-etiketter baseret, for eksempel, på Gadolinium(III) eller trityl, viser enten meget brede spektre og lave modulationsdybder eller meget smalle spektre, der er uegnede til den slags eksperimenter, vi ønsker at udføre." En ny undersøgelse offentliggjort af Drescher, Wittmann og deres team af University of Konstanz kemikere, som blev offentliggjort online i tidsskriftet ChemBioChem Communications den 14. august 2019, introducerer en ny tilgang til mærkning af proteiner, der indeholder nitroxid-baserede spin-mærker og genetisk kodede ikke-kanoniske aminosyrer (ncAA'er) som mål for SDSL.

"Nitroxider giver ideel spektral bredde og adgang til dynamisk information, " siger Anandi Kugele, en doktorgradsforsker ved Konstanz Research School of Chemical Biology (KoRS-CB) og førsteforfatter på undersøgelsen, som modtog et prestigefyldt rejsestipendium fra National High Magnetic Field Laboratory for at præsentere resultaterne ved 2019 Rocky Mountain Conference on Magnetic Resonance i Denver, Colorado (USA). "Traditionelle nitroxidbaserede etiketter har begrænset redoxstabilitet, hvilket er en ulempe for applikationer i cellen. Udfordringen for os var at øge nitroxidstabiliteten og dermed tilpasse nitroxidbaserede spin-etiketter til fremtidig rutinemæssig in vivo-brug." Til det formål, forskerne udviklede en ny spin-label, der kan bindes til proteiner ved hjælp af Diels-Alder (DAinv) cycloaddition med omvendt elektron-efterspørgsel til genetisk kodede ncAA'er, en metode, som har vist sig egnet til en bred vifte af in vitro og in vivo applikationer. For at opnå nitroxidstabilitet, forskerne brugte yderligere en beskyttelsesstrategi baseret på fotoaftagelige beskyttelsesgrupper, som er kendt for at beskytte nitroxider og frigive dem efter behov.

Den nye spin-etiket - kaldet fotoaktiverbart nitroxid til DAinv-reaktion, eller PaNDA for kort - er vandopløseligt, EPR-aktiv og afbeskyttelseseffektiv som både in vitro og i lysattest med de to modelproteiner grønt fluorescerende protein (GFP) og Escherichia coli oxidoreductase thioredoxin (TRX), som findes i stort set alle kendte organismer, antyder. "Vi er nødt til at forbedre den metode, der bruges til at levere PaNDA-spinmærket til celler og til at teste mærknings- og afbeskyttelseseffektivitet inde i cellen, bl.a. " konkluderer Malte Drescher:"Men vores forskning viser tydeligt, at i princippet, PaNDA-mærket kan bruges til EPJ-målinger i udfordrende biologiske miljøer, inklusive indersiden af ​​celler. Vores test med E. coli-lysat er meget lovende i denne henseende. Dette vil åbne op for en helt ny række muligheder for undersøgelse af proteiner ved hjælp af EPR-spektroskopi."