Ny teknologi til proteinbiokonjugation og strukturel proteomik

Forskere ved Det Tjekkiske Videnskabsakademi og den Brno-baserede start-up CF Plus Chemicals, en spin-off af ETH Zürich, har rapporteret om en ny teknologi kaldet CF LINK til stedselektiv biokonjugering af proteiner og deres strukturelle karakterisering. Teknologien kan selektivt fremstille proteinkonjugater via deres tryptofanrester og udføre post-translationel modifikation af aromatiske aminosyrer. Desuden, det kan også bruges som et værktøj til kortlægning af proteinoverflader og undersøgelser af protein-protein-interaktioner.

Virksomheden CF Plus Chemicals, en ETH Zürich spin-off grundlagt i 2014, er baseret på næsten 10 års samarbejde mellem gruppen af ​​Dr. Petr Beier ved Institut for Organisk Kemi og Biokemi ved Det Tjekkiske Videnskabsakademi (IOCB Prag) og Dr. Václav Matoušek, en ph.d. alumnus af prof. dr. Antonio Togni ved ETH Zürich.

Reagenser baseret på cykliske hypervalente jod-perfluoralkylforbindelser, også kaldet Togni-reagenser, er blevet meget brugte og populære værktøjer i organisk syntese, især inden for medicinsk kemi til fremstilling af nye fluorerede lægemiddelkandidater, i tråd med den stigende efterspørgsel efter fluorerede stilladser inden for lægemiddeldesign. I begyndelsen af ​​1990'erne, fluorerede molekyler tegnede sig for 5 procent af det samlede antal godkendte lægemidler; de udgør nu 15 procent, og omkring 30 procent for nyligt godkendte lægemidler.

Denne familie af kemiske forbindelser blev efterfølgende udvidet i 2013 i samarbejde med ETH Zurich og Dr. Petr Beier fra IOCB til en ny generation af patenterede Togni-reagenser, der bærer en mere kompleks RCF2CF2-gruppe i stedet for en simpel CF3-gruppe. Den nye familie af disse kemikalier deler ikke kun den rige reaktivitet fra den første generation af Togni-reagenser, men udviser også praktisk talt ubegrænset strukturel variabilitet af den β-substituerede tetrafluorethylgruppe, som de er i stand til at overføre til en række forskellige substrater, der er relevante for medicinsk kemi af små molekyler.

I 2017 anvendelsespotentialet for anden generation af Togni-reagenser blev udvidet til proteiner. Deres høje affinitet til thiolgruppen tillader selektiv biokonjugation gennem cysteiner for at danne stabile konjugater, som i modsætning til maleimidkonjugater, er ikke udsat for langsom dekonjugation og thioludveksling.

Den foreliggende opfindelse bygger på den tidligere viden om den radikale natur af Togni-reagensmedierede reaktioner. I SME Instrument Horizon 2020-projektet, støttet af byen Brno og i samarbejde med IOCB og Dr. Petr Novák fra Institut for Mikrobiologi ved Det Tjekkiske Videnskabsakademi (IMIC), det blev vist, at Togni reagenser, når det blandes med natriumascorbat, en billig, ikke-toksisk og biokompatibelt reduktionsmiddel, genererer straks ß-substituerede tetrafluorethylradikaler, der selektivt binder sig til sterisk tilgængelige tryptofanrester af proteinet under overgangsmetalfrie betingelser.

Når først azidofluoralkylgrupper er knyttet til proteinet, forskellige funktionelle grupper, såsom fluorescerende farvestoffer, radionuklider eller ADC-toksiner til målrettet onkoterapi kan efterfølgende forbindes via klikreaktion for at give de tilsvarende proteinkonjugater. Den beskrevne tryptofan-selektive biokonjugationsmetode afbryder ikke proteindisulfidbroer og tilbyder en alternativ løsning, hvor konventionel cysteinkonjugation ikke er mulig, for eksempel, på grund af en uønsket disulfid-forvrængning.

Denne biokonjugationsmetode kan også udvides til andre aromatiske aminosyrer og dermed til proteiner, der mangler tryptofan. Dermed, det var muligt med succes at modificere humant rekombinant insulin og vedhæfte op til syv modifikationer til dets aromatiske aminosyrer, demonstrerer potentialet for post-translationel modifikation af proteiner.

Den ekstremt hurtige karakter af denne reaktion rettet mod opløsningsmiddeltilgængelige aromatiske aminosyrer gør den til et praktisk værktøj til at kortlægge proteinoverflader og studere protein-protein-interaktioner. Ved at bruge eksemplet med human carbonanhydrase, forskerne viste, at resultaterne af overfladekortlægning er i fremragende overensstemmelse med dens offentliggjorte oprindelige struktur.

Prof. Dr. Martin Fusek, CEO for IOCB Tech, siger, "Grundlaget for vellykkede kommercielle resultater fra grundforskningsresultater er fremragende videnskabeligt arbejde. Dette er et vigtigt resultat, der ikke kun er nyttigt som et redskab til grundforskning, men også som et middel til udvikling af nye proteinbaserede lægemidler. Det unikke, hvilket snarere burde være reglen, er, at projektet er skabt i samarbejde mellem to akademiske institutioner og en kommerciel virksomhed. Jeg er meget glad for, at vi kunne have været en del af processen."

Dr. Petr Beier, leder af en forskningsgruppe ved IOCB Prag, siger, "Jeg er glad for, at vi har været i stand til at udvikle et succesfuldt tværfagligt samarbejde af organisk syntese og biokemi. Det viser sig, at de specifikke egenskaber ved fluorerede forbindelser ikke kun kan udnyttes traditionelt i den medicinske kemi af små molekyler. men som for nylig også vist for biokonjugering af proteiner og undersøgelser af deres struktur. Jeg tror på, at vi i fremtiden vil være i stand til at identificere andre attraktive anvendelser af Togni-reagenser i biokemi."

Dr. Petr Novák, leder af en forskningsgruppe hos IMIC, siger, "Takket være Togni-reagenser har vi været i stand til at introducere en fluoreret probe i proteinstrukturen i et vandigt miljø på få sekunder. Vi er nu i stand til at bruge denne teknologi til selektivt at mærke proteiner til klinisk diagnostik eller bruge den til at identificere interaktionsgrænsefladen mellem proteiner og deres ligander."

Dr. Václav Matoušek, CEO for CF Plus Chemicals, siger, "Jeg er spændt på at se, at Togni-reagensernes reaktivitet kan udvides til aromatiske aminosyrer og aromater generelt, dermed åbne et væld af potentielle applikationer, især inden for proteinvidenskab og proteinbaseret terapi. Vi leder nu aktivt efter etablerede industrielle partnere, der kan anvende vores teknologi til at løse deres udfordringer."