Hurtig metode hjælper med at detektere Arf6 guanin nukleotid udvekslingsfaktor aktivitet

Et forskerhold ledet af prof. Wang Junfeng fra Hefei Institutes of Physical Science (HFIPS) under det kinesiske videnskabsakademi (CAS) har udviklet en ny endimensionel (1D) fluor-19 ( ¹⁹ F) nuklear magnetisk resonans (NMR)-baseret metode til hurtig påvisning af Arf6 guanin nucleotid exchange factor (GEF) aktivitet.

Deres resultater blev offentliggjort i Analytical Chemistry den 6. juni.

Små GTPaser (sGTPase) er involveret i signalkaskader, der styrer en bred vifte af cellulære responser. Alle sGTPaser kan findes i to tilstande:en inaktiv tilstand, hvor den lille GTPase er bundet til Guanosin diphosphat (GDP), og en aktiv tilstand, hvor den er bundet til Guanosin triphosphat (GTP). GTPase-cyklussen dannet af interkonverteringen mellem de to tilstande er strengt reguleret af guanin-nukleotidudvekslingsfaktorer (GEF'er) og GTPase-aktiverende proteiner (GAP'er).

Mutation eller unormal regulering af sGTPase-proteiner eller deres respektive GEF'er/GAP'er er tæt beslægtet med mange sygdomme, herunder cancer. Derfor er det vigtigt at detektere aktiviteten af ​​disse GEF/GAP-proteiner både in vitro og in vivo.

I denne undersøgelse inkorporerede forskerne den unaturlige aminosyre tfmF-stedspecifikt i Phe47 af sGTPase Arf6, en position placeret i ARF6-omskiftningsdomænet, hvis konformation ændrer sig mest under GTPase-cyklus. Og de udviklede 1D ¹⁹ F NMR-baseret metode til at detektere GEF-aktivitet i oprenset proteinsystem eller i nærværelse af cellelysater.

Til et GEF-aktivitetsassay blev prøven af ​​GDP-ladet Arf6-F47 tfmF sat ind i spektrometeret så hurtigt som muligt efter tilføjelse af en GEF og GTP. En sekventiel serie af 1D ¹⁹ F NMR-spektre blev opsamlet. Signalet fra Arf6-F47 tfmF i den GTP-bundne tilstand blev behandlet og integreret. De kinetiske udvekslingskurver blev derefter plottet og tilpasset til en enkeltfaset eksponentiel vækstkurve for at udtrække hastigheden.

"Denne strategi kan potentielt bruges til at overvåge konformationsændring af Arf6 eller anden sGTPase," sagde Wu Bo, førsteforfatter af undersøgelsen, "den kan detektere aktiviteterne af sGTPases regulatoriske proteiner i fysiologiske og patologiske miljøer." + Udforsk yderligere

Forskere udpeger en mekanisme, der kontrollerer celleproteintrafik