Visualisering af intracellulære nanostrukturer af levende celler ved hjælp af nanoendoskopi-AFM

Atomic force microscopy (AFM) tilbyder en metode til etiketfri billeddannelse af biomolekylær dynamik i nanoskala for at løse biologiske spørgsmål, der ikke kan løses via andre bioimaging metoder, herunder fluorescens og scanning elektronmikroskopi. Da sådanne billeddannelsesmetoder kun er mulige for biologiske systemer udvundet fra celler eller rekonstrueret på faste substrater, forbliver nanodynamik i levende celler stort set utilgængelig med eksisterende biobilleddannelsesmetoder. I en ny rapport, der nu er offentliggjort i Science Advances , Marcos Penedo og et forskerhold i Nanolife Science og bioteknologi ved Kanazawa University i Japan, overvandt grænserne for bioimaging ved at bruge nanoendoskopi-AFM. Under processen indsatte de en nålelignende sonde i en levende celle for at præsentere actinfiber, tredimensionelle (3D) kort og 2D nanodynamik af membranens indre stillads med uopdagelige ændringer i cellelevedygtighed. I modsætning til tidligere AFM-metoder fik nanoproben direkte adgang til de intracellulære målkomponenter og udforskede AFM's muligheder, herunder højopløsningsbilleddannelse, nanomekanisk kortlægning og molekylær genkendelse for at udvide det observerbare udvalg af intracellulære strukturer i levende celler.

Biobilleddannelse af intracellulær dynamik

Molekylær skala dynamik af intracellulære komponenter giver indsigt i de grundlæggende mekanismer for cellefunktioner og sygdom. Imidlertid er direkte billeddannelsesmetoder til sådan nanodynamik i levende celler udfordrende. For eksempel, mens elektronmikroskopi er nyttig til at afbilde nanostrukturer af frosne celler i vakuum, er de ude af stand til at afbilde nanodynamik i levende celler under fysiologiske miljøer, undtagen som statiske øjebliksbilleder af faste konformationer. På samme måde, mens fluorescensmikroskopi via fluorescensmærkning giver en kraftfuld metode til at visualisere dynamikken af ​​proteiner og organeller i levende celler, er de begrænset af en manglende evne til effektivt at afbilde på nanoskala. Der er derfor store krav til en mærkefri intracellulær billeddannelsesmetode i flydende miljøer. Atomic force microscopy (AFM) er en potentiel kandidat til rollen med kapacitet til at afbilde på sub-nanometer skala for at visualisere nanodynamik af lipider, proteiner og DNA'er uden mærker. Sådanne billeder er imidlertid ikke repræsentative for biologiske systemer som et resultat af ekstraktion fra en celle eller rekonstruktion på et fast substrat in vitro. I dette arbejde har Penedo et al. foreslået en AFM-baseret billeddannelsesmetode kendt som nanoendoskopi-AFM til at observere nanodynamik inde i levende celler uden at mærke eller skille dem ad.

Nanoendoskopi-AFM-eksperimenter

Under eksperimenterne, ligesom et endoskopisk kamera, indsatte forskerne en lang nållignende nanoprobe inde i en levende celle for at udføre 2D- og 3D AFM-billeddannelse. Holdet viste, hvordan nanoendoskopi-AFM gav en unik fordel for mærkefri intracellulær levende-celle-billeddannelse på nanoskala. Metoden giver en stærk vej til at observere hidtil uudforskede fænomener i biologiske systemer. Penedo et al. gentagne gange indført nanoproben inde i cellen ved forskellige positioner af det ønskede område via kraft versus afstand kurvemålinger. For at afbilde hele cellen skulle nanoproben være lang nok til at trænge fuldstændigt ind i cellen, indtil den nåede substratet, og med diametre under 200 nm for at minimere celleskade, samtidig med at membrangennemtrængning blev lettere. Holdet brugte en kommerciel silicium tetraedrisk spids som en nanoprobe, som de fræsede ved hjælp af fokuseret ionstrålefræsning til de foretrukne dimensioner. Holdet brugte derefter nanoproberne inde i forskellige områder af en HeLa-celle. De erhvervede et 3D nanoendoskopi-AFM-billede af en hel celle under eksperimenterne og identificerede kernen af ​​HeLa-cellen fra resten af ​​cellen. Yderligere målinger viste også de indre granulære strukturer. For at minimere celleskade under penetration, har Penedo et al. reduceret indtrængningskraften og fordybningslængden så meget som muligt. De udførte også cellelevedygtighedseksperimenter for at bekræfte, at 3D nanoendoskopi-AFM ikke førte til alvorlig celleskade ved brug af nanoprober med diametre under 200 nm. Ved hjælp af 3D nanoendoskopi-AFM lettede de billeddannelse af det indre cytoskelet i levende celler for at observere 3D-organisering af de ikke-understøttede fibre. Holdet har også succesfuldt fusioneret intracellulære billeder som følge af 3D nanoendoskopi-AFM og konfokal mikroskopi.

2D nanoendoskopi-AFM

Evnen til at indsætte en lang nanoprobe i en celle mange gange og samtidig bevare cellelevedygtighed indebar potentialet til at lokalisere spidsen af ​​sonden i en levende celle for at udføre lokale 2D/3D AFM-målinger uden væsentlig skade. Nanoproben kunne indsættes i cellen for at måle den cytoplasmatiske side af cellemembranen via amplitudemodulationstilstand AFM. Nanoproberne skulle være lange nok til at trænge helt ind i cellen og nå dens bund, samtidig med at de var tynde nok til at reducere celleskader. For at opnå dette i praksis har Penedo et al. udviklede nanoprober lavet af amorft kulstof ved hjælp af elektronstråleaflejring og målte amplitudeafhængigheden af ​​afstanden, for at bestemme cellens integritet. De udførte 2D nanoendoskopi-AFM eksperimenter ved hjælp af en fibroblastcelle for at illustrere den retikulære struktur af den indre cellemembran og observerede cellearkitekturen for at studere indre dynamik af cellestrukturer. Arbejdet fremhævede muligheden for at bruge 2D nanoendoskopi-AFM til at studere nanodynamik af interne strukturer i levende celler under fysiologiske miljøer.

Outlook

På denne måde viste Marcos Penedo og kolleger anvendelserne af nanoendoskopi-AFM til at måle cytoplasmatiske indre overflader af cellemembraner og tilhørende stilladser for at forstå 3D-arrangement af actinfilamenter i deres naturlige intracellulære miljø i levende celler. Holdet forsøgte at minimere celleskade ved at bruge ultratynde nålelignende nanoprober i eksperimenterne. De foreslåede AFM-metoder producerede 3D-kort over interne cellestrukturer ud over 2D-projektioner kombineret med eksisterende fluorescensmetoder såsom konfokal eller superopløsningsmikroskopi. Metoden vil kaste lys over cellemaskineri i aktion, in vivo, samtidig med at fysiologiske molekylære motorer eksponeres. Metoden vil også åbne nye muligheder for at studere intracellulær nanomekanik, der spiller en vigtig rolle i cellulære funktioner. Holdet kan bruge metoden til at måle kernens stivhed, adhæsion og spredningsegenskaber til at udtrække biologisk information, der er egnet til tværfaglige områder inden for cellebiologi og medicin. + Udforsk yderligere

Ny billedbehandlingsmetode giver et levende indblik i, hvordan celler fungerer

© 2022 Science X Network