Udvikling af en ny farvepalet til enkelt-molekyle billeddannelse

Forskere studerer ofte biomolekyler såsom proteiner eller aminosyrer ved kemisk at vedhæfte en "fluorofor", et følsomt molekyle, der absorberer og genudsender energi fra lys.

Når de aktiveres af en laser og afbildes gennem et kraftigt mikroskop, eksploderer disse fluoroformærker eller etiketter i en regnbue af farver og information. De giver et væld af indsigt, der for eksempel kan hjælpe med at opdage sygdomme eller identificere genetiske tilstande.

For at detektere mere end én type molekyle ad gangen, eller "multipleks" målinger, bruges yderligere typer fluoroforer, der udsender forskellige farver af lys. Men det er overraskende svært at skelne mellem forskellige farver på enkeltmolekyleniveau. Det er derfor, de fleste mikroskoper kun ser på tre til fire farver.

Forskere kan bryde denne farvebarriere ved hjælp af avancerede teknikker, der involverer dagelange runder med mærkning og billeddannelse eller anvender komplicerede opsætninger med mange lasere. Det er dog fortsat en stor udfordring at finde en enkel og hurtig måde at se mange farver på.

Forskere ved UChicago Pritzker School of Molecular Engineering har en ny løsning på denne udfordring, skitseret i et papir offentliggjort i dag i Nature Nanotechnology . En ny teknik skitseret af Squires Lab bruger tre simple kemiske byggesten til at konstruere snesevis af "FRETfluor"-tags, hvilket skaber et smukkere, nuanceret spektrum af farver, forskere kan bruge til at mærke biomolekyler.

"Vores tilgang er nemmere. Det er et skud af mærkning, et skud af billeddannelse," sagde medforfatter Jiachong Chu, en UChicago Pritzker Molecular Engineering Ph.D. kandidat. "Det betyder, at du kan gøre mere med mindre. I øjeblikket er vores nye teknik den bedste på området."

En ny vej mod multipleksing

Individuelle molekyler er små, og celleprøver er forholdsvis store, komplicerede og rodede. Det ultimative mål med dette forskningsområde – et som PME-teamets papir sætter tættere på end nogensinde før – er multipleksing.

"Multipleksing af prøver betyder at være i stand til, i samme måling, at måle mere end én art af molekyler, så måske har du 10 eller 50 eller hundredvis af forskellige proteiner, som du vil identificere," sagde Neubauer Family Assistant Professor of Molecular Engineering Allison Squires. "Med denne nye teknik kan vi dusinvis. Jeg tror, ​​vi kan udvide det til hundredvis."

For at tackle denne udfordring fandt Squires Lab-teamet en innovativ ny måde at bruge en veletableret teknik på:Förster Resonance Energy Transfer eller FRET. FRET er en mekanisme, der beskriver, hvordan energi overføres mellem lysfølsomme molekyler. Det er en måde for forskere at måle afstanden mellem forskellige dele af et molekyle eller at rapportere, når to molekyler interagerer. FRET-signaler er usædvanligt følsomme over for egenskaberne af de deltagende fluoroforer, som UChicago-teamet brugte til at tune deres FRETfluor-mærker.

"Dette projekt bruger FRET på en ny måde," sagde medforfatter Ayesha Ejaz, en Ph.D. kandidat i kemi. "FRET bruges almindeligvis til at måle afstande og observere dynamik i biomolekyler. Vi ændrede afstanden mellem et donor- og acceptorfarvestof for at skabe forskellige FRET-effektiviteter og andre egenskaber, som vi bruger til at identificere de forskellige konstruktioner."

De 27 tags, der blev brugt i PME-holdets forskning, var 27 "FRETfluors", de designet ved hjælp af en simpel kombination af DNA, et grønt cyaninfarvestof (Cy3) og et rødt cyaninfarvestof (Cy5). Ud over at gløde i forskellige farver, udviser FRETfluorer hver især andre afstembare egenskaber, såsom timingen af, hvordan fotoner udsendes, eller hvad disse fotoners orientering er.

Tilsammen kan disse egenskaber bruges til at identificere en FRETfluor på kun en brøkdel af et sekund ved ultralave koncentrationer. Ejaz sagde, at en mulig fremtidig retning for denne forskning er til sidst at erstatte almindelige fluorofor-tags med disse FRETfluors.

"Normalt, når folk ønsker at se på flere ting - såsom forskellige dele af en celle - på én gang, mærker de hver komponent med et andet fluorescerende tag, der udsender en bestemt farve af lys. Men fluorescerende tags er begrænset til fire eller fem farver ," sagde Ejaz.

"Hvis FRETfluors kan bruges i stedet, så kan vi øge antallet af 'farver', der er tilgængelige til fluorescensmikroskopi. Vi tester i øjeblikket, hvor godt FRETfluorerne virker i forskellige typer eksperimenter og miljøer, hvilket vil give os en bedre forståelse af alle mulighederne."

"Jeg er spændt på at se FRETfluorerne i aktion," sagde hun.

Følsomhed og enkelhed

For Squires kommer meget af appellen ved den nye multipleksingsteknik fra følsomhed kombineret med enkelhed.

"Alle ønsker at multiplekse deres yndlingsanalyse, og der er masser af eksisterende strategier, der vil fungere i visse situationer," sagde hun. "Der er teknikker, der fungerer godt, når du har masser af tid, eller når din prøve er død, så intet bevæger sig.

"Vi angriber problemet, hvor du ikke har tonsvis af tid. Du vil vide, hvilken sygdom nogen har, mens der stadig er tid til at bekæmpe den, eller du har kun en lille bitte smule prøve, og du får et skud til at identificere hvert molekyle, når det strømmer gennem din kanal. Vi kan identificere FRETfluorer på en brøkdel af et sekund ned til titusindvis af femtomolære koncentrationer."

Enkelhed er nøglen, både ved at bruge almindelige kemikalier til at fremstille FRETfluorerne og ved at være banebrydende for en teknik, der kun kræver én laser til udlæsning.

"Vi mærker kun til mål én gang og laver kun udlæsningen én gang," sagde Chu. "I den sammenhæng kan vi oprette 27 forskellige tags, som kan bruges på samme tid."

Squires beskrev, hvordan eksisterende teknikker kunne bruges sammen med FRETfluors til flere multipleksing-forstærkninger - "du kunne introducere smarte laser-excitationsskemaer eller inkorporere andre fluoroforer, der har lidt andre egenskaber" - som ville forbedre udlæsningerne fra eksisterende etiketter.

Anvendelse af disse multiplikatorer på deres nye, mere kraftfulde teknik, sagde Squires, kan åbne op for verdener af ny forskning og applikationer.

"Disse forbedringer af billeddannelse og flow-baserede biomedicinske analyser vil muliggøre den næste generation af innovation," sagde Squires.

Flere oplysninger: Jiachong Chu et al., Single-molecule fluorescence multiplexing ved multi-parameter spektroskopisk detektion af nanostrukturerede FRET-mærker, Nature Nanotechnology (2024). DOI:10.1038/s41565-024-01672-8

Journaloplysninger: Naturenanoteknologi

Leveret af University of Chicago