Nyt enkeltcellet nanopore-sekventeringsværktøj fremskynder analyse af tumorceller

Northwestern Medicine-forskere ledet af Ruli Gao, Ph.D., assisterende professor i biokemi og molekylær genetik, har udviklet et nyt genetisk sekventeringsværktøj, der accelererer sekventeringsanalyse af samme-celle genotyper og fænotyper i tumorer, som beskrevet i en undersøgelse offentliggjort i Naturkommunikation .

Enkeltcellet nanopore RNA-sekventering er en nyere type genetisk sekventering, der skubber nuværende high-throughput enkeltcelle RNA-sekventeringsteknikker frem fra næste generations sekventering (NGS), som kun kan sekvensere korte strenge af RNA'er, til langlæst tredje- generationssekventering (TGS), som direkte kan måle den fulde længde af RNA'er.

Den avancerede teknik er dog også kendt for at producere høje sekventeringsfejl og er også afhængig af sekvensering af korte læsninger - generering af matchede NGS-data til at vejlede identifikation af cellulære data - eller på at bruge en stregkodehvidliste til at opdele dataene i ægte celler og enkelte molekyler.

"Denne teknik er afhængig af cellestregkoder og enkeltmolekylestregkoder, det vi kalder unikke molekyleidentifikatorer, for at opnå høj gennemstrømning, så man ser udfordringerne på grund af højere sekventeringsfejl i stregkodesekvenser. Aktuelt tilgængelige metoder afhænger af næste generations data eller afhænger af en teoretisk hvidliste til at genkende, hvilke der er ægte cellestregkoder og unikke molekyle-identifikatorer," sagde Gao, som også er medlem af Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center ved Northwestern University.

For at forbedre denne proces udviklede Gaos team scNanoGPS (enkeltcellet Nanopore-sekventeringsanalyse af genotyper og fænotyper samtidig), et nyt sekventeringsværktøj, der udfører fuldstændig uafhængig dekonvolution af fejltilbøjelige langlæsninger til enkelte celler og enkelte molekyler.

"For yderligere at lette anvendelsen af ​​ny teknologi inden for genomisk forskning konstruerer scNanoGPS yderligere funktionelle moduler til at beregne både genotyper (mutationer) og fænotyper (gen- og isoform-ekspressioner) i individuelle celler ud fra enkeltcellede nanopore-RNA-sekventeringsdata med høj gennemstrømning," sagde Cheng-Kai Shiau, Ph.D., en postdoc-stipendiat i Gao-laboratoriet og medførsteforfatter af undersøgelsen.

scNanoGPS øger sekventeringsgennemstrømningen fra hundredvis til tusindvis af celler, hvilket kan sammenlignes med nuværende bredt anvendte kortlæsningsbaserede enkeltcellede RNA-sekventeringsteknikker, og ekspressionsprofilerne mellem kortlæste og langlæste data er meget overensstemmende, ifølge Gao.

"På grund af dækning af hele genkroppen muliggør langaflæste data beregninger af splejsning af isoformer og genetiske ændringer, som stort set savnes af kortlæst enkeltcellet RNA-sekvensering," sagde Gao.

For at validere deres værktøj brugte Gaos team scNanoGPS til at sekvensere nyretumorceller og lymfocytter og fandt ud af, at cellerne udtrykker celletypespecifikke kombinationer af isoformer og genetiske mutationer.

"Vi fandt celletypespecifikke isoformer, herunder både tumorcellespecifikke isoformer og immuncellespecifikke isoformer, og demonstrerede også celletypespecifikke mutationsprofiler inden for de samme tumorer," sagde Lina Lu, Ph.D., en postdoktor i Gao laboratorium og medforfatter af undersøgelsen.

"Det er kendt, at alternative splejsningsisoformer er en kritisk post-transkriptionsmekanisme til at øge proteinkompleksiteten i humane celler. Vi er glade for at bemærke, at scNanoGPS muliggør direkte måling af splejsningsisoformer på enkeltcelleniveauer," sagde Gao.

Hvad angår fremtidige applikationer, håber Gao, at scNanoGPS kan bruges til at identificere celletype-specifikke isoformer, der bidrager til forskellige menneskelige sygdomme såsom cancer, hjertesvigt og endda afstødning af organtransplantationer.

"Nye teknologier gør datagenerering relativt nemmere, men forskere kan ikke bruge nye datatyper effektivt uden et robust beregningsværktøj. scNanoGPS udfylder et hul mellem teknologierne og applikationerne. Vi håber at gøre den kraftfulde langlæste enkeltcelle-sekventeringsteknologi tilgængelig og tilgængelig til alle generelle laboratorier," sagde Gao.

Flere oplysninger: Cheng-Kai Shiau et al, High throughput enkeltcellede langlæste sekventeringsanalyser af samme-celle genotyper og fænotyper i humane tumorer, Nature Communications (2023). DOI:10.1038/s41467-023-39813-7

Journaloplysninger: Nature Communications

Leveret af Northwestern University