Ude-i-omprogrammering:Antistofundersøgelse foreslår en bedre måde at lave stamceller på

Forskere ved The Scripps Research Institute (TSRI) har fundet en ny tilgang til "omprogrammering" af almindelige voksne celler til stamceller.

I en undersøgelse offentliggjort i dag i et Advance Online -papir i Naturbioteknologi , TSRI-forskerne screenede et bibliotek med 100 millioner antistoffer og fandt flere, der kan hjælpe med at omprogrammere modne hudlignende celler til stamceller kendt som inducerede pluripotente stamceller (IPSC'er).

At lave IPSC'er fra mere modne celletyper involverer normalt indsættelse af fire transskriptionsfaktorgener i disse cellers DNA. Antistofferne identificeret af forskerne kan påføres modne celler-hvor de binder til proteiner på celleoverfladen-som en erstatning for tre af standardtranskriptionsfaktoren gen-insertioner.

"Dette resultat tyder på, at vi i sidste ende muligvis kan lave IPSC'er uden at putte noget i cellekernen, hvilket potentielt betyder, at disse stamceller vil have færre mutationer og generelt bedre egenskaber, "sagde undersøgelses seniorforfatter Kristin Baldwin, lektor i TSRIs afdeling for neurovidenskab.

IPSC'er kan laves ud fra patienternes egne celler, og har et væld af potentielle anvendelser i personaliserede celleterapier og organregenerering. Imidlertid, ingen af ​​IPSC'ers påtænkte kliniske anvendelser er endnu blevet realiseret, dels på grund af de risici, der er forbundet med at lave dem.

Standard IPSC -induktionsprocedure, udviklet for ti år siden og kendt som OSKM, involverer indsættelse i voksne celler af gener for fire transkriptionsfaktorproteiner:Oct4, Sox2, Klf4 og c-Myc. Med disse gener tilføjet og aktive, de transkriptionsfaktorproteiner, de koder, produceres og omprogrammerer cellerne til IPSC'er.

Et problem med denne procedure er, at de virale indsættelseshændelser eller overproduktion af de nukleare omprogrammeringsfaktorer kan beskadige celle -DNA på en måde, der gør cellen kræft. En anden er, at denne nukleare omprogrammering typisk giver en samling IPSC'er med variable egenskaber. "Denne variation kan være et problem, selv når vi bruger IPSC'er i laboratoriet til at studere sygdomme, "Sagde Baldwin.

I modsætning, under almindelig dyreudvikling, celleidentitet ændres af molekylære signaler, der kommer ind uden for cellen og fremkalder ændringer i genaktivitet, uden nogen risikofyldte indsættelser af DNA. For at finde naturlige veje som disse - gennem hvilke almindelige celler kunne omdannes til IPSC’er - gik Baldwin og hendes laboratorium sammen med TSRI -laboratoriet af Richard Lerner, Lita Annenberg Hazen professor i immunkemi. Lerner har været med til at pionere udviklingen og screeningen af ​​store biblioteker af humane antistoffer til at finde nye antistofbaserede lægemidler og videnskabelige prober.

I dette tilfælde, holdet, herunder kandidatstuderende Joel W. Blanchard og postdoc -forsker Jia Xie, der var hovedforfattere, oprettet et bibliotek med omkring 100 millioner forskellige antistoffer og brugte det til at finde alle, der kunne erstatte OSKM-transkriptionsfaktorer.

I et indledende sæt af eksperimenter, forskerne forsøgte at identificere antistoffer, der kan erstatte både Sox2 og c-Myc. De etablerede en stor population af musefibroblastceller - ofte brugt til at lave IPSC'er i forsøg - og indsatte generne for de to andre transkriptionsfaktorer, 4. okt og Klf4. Dernæst tilføjede de deres enorme bibliotek af antistofgener til cellernes population, sådan, at hver celle endte med at indeholde generne for et eller flere af antistofferne.

Forskerne kunne derefter observere, hvilke af cellerne der begyndte at danne stamcellekolonier - hvilket indikerer, at et af antistofferne produceret af disse celler med succes havde erstattet funktionerne i Sox2 og c-Myc og udløst skiftet i celleidentitet. Sekventering af disse cellers DNA gjorde det muligt for forskerne at bestemme de ansvarlige antistoffer.

På denne måde, TSRI-teamet opdagede to antistoffer, der kan erstatte både Sox2 og c-Myc, og i et lignende sæt tests fandt de to antistoffer, der kan erstatte en tredje transkriptionsfaktor, 4. okt. Forskerne viste, at i stedet for at indsætte disse transkriptionsfaktorgener kunne de ganske enkelt levere antistofferne til fibroblastcellerne i kulturen.

I denne indledende undersøgelse, forskerne kunne ikke finde antistoffer, der erstatter funktionen af ​​den fjerde OSKM -transkriptionsfaktor, Klf4. Imidlertid, Baldwin forventer, at hun og hendes kolleger med mere omfattende screening i sidste ende også vil finde antistoferstatninger for Klf4. "Den, tror jeg, vil tage os et par år mere at finde ud af, " hun sagde.

Antistof-screeningsmetoden giver i princippet forskere mulighed for ikke kun at finde antistoffer, der kan erstatte OSKM-transkriptionsfaktorer, men også for at studere de naturlige signalveje, gennem hvilke disse antistoffer virker.

I et bevis på dette princip, forskerne fandt ud af, at et af de Sox2-erstattende antistoffer binder til et protein på cellemembranen kaldet Basp1. Denne bindende hændelse blokerer Basp1's normale aktivitet og fjerner dermed begrænsningerne på WT1, et transkriptionsfaktorprotein, der virker i cellekernen. WT1, sluppet løs, ændrer derefter aktiviteten af ​​flere gener, i sidste ende inklusive Sox2'er, at fremme stamcellens tilstand ved hjælp af en anden hændelsesorden end ved brug af de originale omprogrammeringsfaktorer.

WT1 (Wilms tumor 1) er overproduceret i nogle kræftformer og betragtes som et onkogen. Denne kendsgerning fremhæver en merværdi af sådanne undersøgelser:at hjælpe forskere med at forstå forholdet mellem kræftcelleudvikling og stamcellens tilstand.

TSRI -forskerne planlægger nu større, mere komplekse antistof-screeningsundersøgelser ved hjælp af humane celler frem for museceller.