Drev lægemiddelresistens ud af svampe

Candida albicans er et berygtet menneskeligt svampepatogen, der forårsager trost og alvorlige systemiske infektioner. Opportunistiske C. albicans svampe, som ofte lever ubemærket i den normale flora af menneskelig hud og tarm, kan skifte fra deres harmløse stealth -tilstand til at blive aggressive patogener, især hos mennesker, hvis immunsystem allerede er kompromitteret af allerede eksisterende sygdomme eller hårde lægemiddelterapier. De kan også danne biofilm på medicinsk udstyr, såsom katetre og stenter i menneskekroppen, fører til infektioner og nogle gange død. Truslen fra både frie og biofilmbundne former for patogenet vokser konstant, som virulente C. albicans -stammer bliver stadig mere resistente over for de få lægemidler, der er tilgængelige til behandling af dem.

Mikrobiologer står over for enorme vanskeligheder i deres søgen efter at bekæmpe C. albicans 'narkotikaresistens og dannelse af biofilm. Hver C. albicans mikrobe er en "diploid" organisme, da det normalt indeholder to kopier af hele dets genom og af alle de gener, der er kodet indenfor. Imidlertid, at forstå den rolle, som et specifikt gen spiller, forskere skal kunne slette begge kopier på samme tid, giver dem mulighed for at observere virkningerne af genets totale fravær, hvilket har været en vanskelig udfordring hos C. albicans. Ud over, gener spiller ofte meget ens og undertiden overflødige roller i mange processer, herunder lægemiddelresistens og dannelse af biofilm, hvilket betyder, at mere end ét gen skal slettes for at identificere de gener, hvis funktioner er forbundet.

For at nærme sig genet sletningsudfordringen i C. albicans, et samarbejdesteam ledet af James Collinsand George Church, to kernefakultetsmedlemmer ved Harvards Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering, har udviklet en CRISPR-Cas9-baseret "gen drive" platform til at skabe diploide stammer af patogenet, hvor begge genkopier effektivt kunne slettes. Teknikken kan føre vejen mod en bedre forståelse af lægemiddelresistens og biofilmdannende mekanismer, og gennem fremtidig forskning, det kan hjælpe med at finde nye lægemiddelmål og kombinationsbehandlinger. Undersøgelsen er offentliggjort i Naturmikrobiologi .

Holdet udnyttede en nyligt opdaget meget sjælden "haploid" form for C. albicans, som, ligesom andre svampes indeholder kun et sæt kromosomer med en kopi af hvert gen, men de kan parres for let at skabe den diploide form. "Vi brugte haploide C. albicans -stammer og erstattede gener, som vi ønskede at eliminere med et 'gen -drev', som vi tidligere udviklede og tilpassede til den specifikke biologi af C. albicans. Efter parring, disse 'egoistiske genetiske elementer' fortsætter med at erstatte den normale kopi af genet i diploide svampe, "sagde Kirken, Ph.d., som er professor i genetik ved Harvard Medical School og i sundhedsvidenskab og teknologi ved Harvard og MIT. "Fremgangsmåden fungerede så effektivt, at den gjorde det muligt for os endda at slette par forskellige gener samtidigt med højere gennemstrømning og undersøge, om deres funktioner er relaterede."

Den nye gen-drive-tilgang er baseret på CRISPR-Cas9-systemet, hvor et DNA-skærende Cas9-enzym er målrettet mod to regioner, der flankerer et gen i haploide C. albicans-svampe af to såkaldte guide-RNA'er (gRNA'er). Efter at den målrettede gensekvens er blevet skåret ud, en manipuleret gen -drevkassette, der udtrykker alle Cas9- og gRNA -komponenter, indsættes i stedet. Når to haploide svampe parres til dannelse af diploide afkom, gendriften vil også erstatte genets modstykke i det andet kromosom, effektivt slette den originale version helt fra organismen.

Ved at anvende deres gen -sletningsmetode, teamet var i stand til at identificere kombinationer af gener, der virker synergistisk for at trodse visse lægemidler, eller ved at udløse dannelse af biofilm. "For eksempel, slette enten de to efflux-pumpekodende gener CDR1 og CDR2, eller TPO3 og CDR2 sammen, gjort C. albicans meget følsom over for fluconazol og andre svampedræbende lægemidler, tyder på, at målretning mod to mekanismer på samme tid kan hjælpe med at overvinde lægemiddelresistens, "sagde Rebecca Shapiro, Ph.d., en postdoktor i Collins 'team. Shapiro gik sammen med Alejandro Chavez, Ph.d., som første medforfattere til publikationen. Chavez er en tidligere postdoktor, der arbejdede med Church og Collins; han er nu adjunkt ved New York Columbia University. "I biofilmdannelsesassays, vi fandt også, at tab af ALS3 -adhæsionsfaktorgenet synergiserer med tabet af flere andre adhæsionsfaktorgener, hvilket gør det til et stærkt sammenkoblet knudepunkt for vedhæftning af biofilm og en interessant kandidat at undersøge nærmere. "

Undersøgelsen giver nye indgreb i forståelsen af ​​det vanskelige område for C. albicans patogenese og lægemiddelresistens. "Vi kan nu få et langt bedre styr på, hvordan genetiske netværk, der ligger til grund for C. albicans virulens, er organiseret, se, hvordan de reagerer på specifikke miljø- og lægemiddelforstyrrelser, og derved afdække nye sårbarheder, at det i fremtiden kan føre til nye lægemiddelmål og kombinationsbehandlinger, "sagde Collins, Ph.d., som også er Termeer -professor i medicinsk teknik og videnskab ved Massachusetts Institute of Technology (MIT) og professor i biologisk teknik ved MIT. "I øvrigt, vores gen -drive array -platform kan være en blueprint for lignende fremgangsmåder i andre svampepatogener, såsom den nyopståede Candida auris, som er yderst lægemiddelresistent og allerede er blevet markeret som en trussel af centrene for sygdomsbekæmpelse og forebyggelse. "

"Dette symbiotiske samarbejde mellem fakultetsledere for to af Wyss Institutes Enabling Technology Platforms, Jim Collins og George Church, ført til vigtig ny indsigt i biologien af ​​dette infektiøse svampepatogen og hvordan det udvikler resistens, ud over at åbne en helt ny vej til design af mere effektive antisvampeterapier, "sagde Wyss Institutes grundlægger, Donald Ingber, M.D., Ph.d., som også er Judah Folkman professor i vaskulær biologi ved HMS og vaskulærbiologiprogrammet på Boston Children's Hospital, samt professor i bioingeniør ved SEAS.