Dræb kontakter til konstruerede mikrober, der er blevet slyngel

Syntetiske biologer tilpasser mikroorganismers genomer med syntetiske genkredsløb for at nedbryde forurenende plastik, ikke-invasivt diagnosticere og behandle infektioner i den menneskelige tarm, og generere kemikalier og ernæring på lange rumflyvninger. Selvom det viser meget lovende i laboratoriet, disse teknologier kræver kontrol- og sikkerhedsforanstaltninger, der sikrer, at de konstruerede mikroorganismer holder deres funktionelle genkredsløb intakte over mange celledelinger, og at de er indeholdt i de specifikke miljøer, de er designet til.

Tidligere indsats på Harvard's Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering ledet af kernefakultetets medlemmer Pamela Silver og James Collins har skabt "dræbningskontakter" i bakterier, der får dem til at begå selvmord under laboratorieforhold, når de ikke er eftersøgt længere. "Vi var nødt til at tage vores tidligere arbejde videre og udvikle kill-switches, der er stabile i det lange løb og også ville være nyttige i virkelige applikationer, " sagde Silver, som også er Elliot T. og Onie H. Adams professor i biokemi og systembiologi ved Harvard Medical School (HMS). Hendes forskerhold rapporterer nu ind Molekylær celle to nye typer kill-switches, der løser disse udfordringer. De nye kill switches er selvforsynende og meget stabile i bakteriepopulationer, der udvikler sig, og de holder i mange generationer. De kan sikre, at kun bakterier med intakte syntetiske genkredsløb overlever, eller begrænse bakterier til et målmiljø ved 37°C (kropstemperatur), mens de får dem til at dø ved lavere temperaturer, som vist under bakteriel udgang fra en muse-tarmkanal.

For den første type afbryderkontakt, "Essentializer", Silvers team udnyttede deres tidligere konstruerede "hukommelseselement", der gør det muligt for E. coli-bakterier at huske et møde med en specifik stimulus i deres miljø. Hukommelseselementet, stammer fra en bakterie-inficerende virus kaldet bakteriofag lambda, enten forbliver tavs eller rapporterer forekomsten af ​​et signal ved permanent at tænde for et synligt reporter-transgen, som forskerne kan spore. Signalet kan være et hvilket som helst molekyle, for eksempel, et inflammatorisk cytokin i tarmen eller et toksin i miljøet.

I deres nylige undersøgelse, holdet udtænkte en måde, der sikrer, at hukommelseselementet ikke går tabt fra genomet under udviklingen af ​​bakteriepopulationen over mere end hundrede generationer. I det tidsrum, genomerne af individuelle bakterier erhverver tilfældige mutationer, som også potentielt kan forekomme i hukommelseselementet, ødelægger det i deres kølvand. Forskerne introducerede Essentializer som et separat element et andet sted i bakteriens genom. Så længe hukommelseselementet forbliver intakt, en af ​​de to bakteriofagfaktorer, der styrer dens funktion, hæmmer også ekspressionen af ​​et toksin-gen kodet af Essentializer. Imidlertid, toksin-genet forbliver noget "lækkert", stadig producerer restmængder af toksin, der kan dræbe cellen. For at holde de resterende toksinniveauer i skak, forskerne inkluderede et andet gen i deres kill switch, som producerer lave niveauer af et anti-toksin, der kan neutralisere små mængder af toksinet.

"Ved at knytte hukommelseselementets funktion til Essentializerens funktion, vi forbinder dybest set overlevelsen af ​​E. coli-bakterier til tilstedeværelsen af ​​hukommelseselementet. Fjernelse af hukommelseselementet fra bakteriegenomet, som også eliminerer de to toksin-undertrykkende fagfaktorer, udløser øjeblikkeligt kill-kontakten til at producere store mængder toksin, der overvælder anti-toksinet og eliminerer de berørte bakterier fra befolkningen, " sagde førsteforfatter Finn Stirling, en kandidatstuderende, der arbejder med sølv. "For at skabe dette sofistikerede system af checks and balances, vi sørgede også for, at selve dræberkontakterne forblev fuldstændigt intakte, hvilket er en vigtig forudsætning for fremtidige ansøgninger; vi bekræftede, at de stadig var funktionelle efter omkring 140 celledelinger."

Den anden slags dræberafbryder, som holdet kalder "Cryodeath", er i stand til at begrænse bakterier til et specifikt temperaturområde ved at bruge den samme toksin/anti-toksin kombination, men regulere det anderledes. Mens igen, lave niveauer af anti-toksinet blev produceret, toksin-genet var knyttet til en regulatorisk sekvens, der giver kuldefølsomhed. Skifter bakterierne fra 37°C, hvor de skal trives, til 22°C, inducerede kraftigt ekspression af toksinet og dræbte bakterierne. I banebrydende proof-of-concept eksperimenter, holdet demonstrerede nytten af ​​Cryodeath in vivo. Efter at have introduceret en E. coli-stamme indeholdende kill switchen i mus, kun 1 ud af 100, 000 bakterier var levedygtige i fækale prøver. "Dette fremskridt bringer os væsentligt tættere på virkelighedens anvendelser af syntetisk konstruerede mikrober i den menneskelige krop eller miljøet. Vi arbejder nu hen imod kombinationer af kill switches, der kan reagere på forskellige miljøstimuli for at give endnu strammere kontrol, sagde Silver.

"Denne undersøgelse viser, hvordan vores teams udnytter syntetisk biologi ikke kun til at omprogrammere mikrober til at skabe levende cellulære enheder, der kan udføre nyttige funktioner til medicin og miljøsanering, men at gøre dette på en måde, der er sikker for alle, " sagde Wyss Institutes stiftende direktør Donald Ingber, M.D., Ph.D., som også er Judah Folkman-professor i vaskulær biologi ved HMS og Vascular Biology Program på Boston Children's Hospital, samt professor i bioingeniør ved Harvard John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences (SEAS).