Alt-i-et reparationssæt gør CRISPR-genredigering mere præcis

I de sidste fem år, CRISPR-Cas9-teknologien har revolutioneret området for genredigering på grund af dens lethed og lave omkostninger. Men selvom denne teknologi pålideligt finder og skærer den målrettede strækning af DNA-sekvens, at fikse det snit som ønsket har været noget af en hit-or-miss-proces. Fejlrater så høje som 50 procent er et særligt problem, når målet er at rette slåfejl i DNA'et, der forårsager genetisk sygdom.

Nu, et team af forskere ledet af Krishanu Saha, en professor i biomedicinsk ingeniørvidenskab ved University of Wisconsin-Madison, har gjort rettelsen mindre fejltilbøjelig og har offentliggjort sin tilgang i dag (23. nov., 2017) i bladet Naturkommunikation .

Sammenlignet med standard CRISPR-teknologi, den nye metode forbedrer sandsynligheden for at omskrive DNA-sekvensen nøjagtigt som ønsket med en faktor 10. Forskerne opnåede denne meget større præcision ved at udnytte en molekylær lim, kaldet en RNA-aptamer, at samle og levere et komplet CRISPR reparationssæt til stedet for DNA-skæringen.

"Sættet giver ikke kun den molekylære saks, men også den korrekte skabelon for cellemaskineriet at fiksere DNA-udskæringen med, " siger Saha. "Da RNA-aptameren er stærk og meget stabil, alt, hvad vi har brug for, er at komme til det rigtige sted i cellen med ét hug."

I standard CRISPR-teknologi, det bakterieafledte Cas9-protein (saksen) og et guide-RNA-molekyle (for at lokalisere den målrettede DNA-sekvens) leveres til cellen. Når saksen klipper DNA-molekylet op, cellen reparerer hullet med nærliggende DNA-skabeloner, men mere trofast omskrivning er resultatet af at fastgøre de ønskede skabeloner til Cas9/RNA-pakken med den molekylære lim.

Den nye metode har flere andre fordele i forhold til den nuværende teknologi. Først, hyldesættet indeholder kun ikke-virale reagenser, som forenkler fremstillingsprocessen og reducerer sikkerhedsproblemer for kliniske anvendelser af genetisk kirurgi i fremtiden. Sekund, vedhæftning af en RNA-aptamer til sættet er meget lettere end at modificere Cas9-proteinet og giver større fleksibilitet.

"Vi kan tilføje andre biomolekyler til dette sæt, ligesom du ville klikke en ekstra LEGO-klods ind i en allerede eksisterende struktur, " siger Jared Carlson-Stevermer, en kandidatstuderende i Sahas laboratorium og avisens første forfatter.

Et eksempel på en sådan LEGO-blok er fluorescerende tags, der gør det muligt for forskere nemt at identificere alle præcist redigerede DNA-sekvenser i en population af celler.

"Ved at fiske disse mærker ud, vi kan opnå en nøjagtighed på 98 procent, " siger Saha.

Andre typer LEGO-klodser kunne hjælpe med at aktivere reparationssættet i den rigtige slags væv:øjet til behandling af nethindelidelser, eller muskelcellerne hos muskeldystrofipatienter. I den aktuelle undersøgelse, forskerne korrigerede en specifik mutation i stamcellelinjer afledt af en patient med Pompes sygdom med stærkt forbedret troskab. Pompes sygdom er en sjælden arvelig lidelse forårsaget af opbygning af komplekse sukkermolekyler i organer og muskelvæv.

"Der er ingen mangel på kandidater til denne form for genetisk kirurgi, da titusindvis af sygdomme skyldes små sekvensfejl, der kunne rettes med denne teknologi, " siger Saha. "Vores næste mål er at teste metoden i dyremodeller og arbejde på at skrive længere DNA-strækninger."