Team udvikler effektivt vært-vektor-system til en model arkæon ved at løse CRISPR-baseret vært-plasmid konflikt

En forskergruppe har konstrueret alsidige genetiske værktøjer til Saccharolobus islandicus REY15A, en af ​​de meget få arkæiske modeller til arkæabiologi og CRISPR-biologiforskning.

Sådanne værktøjer omfatter effektiv genomredigering, robuste proteinekspressionssystemer, interferensplasmidassay, gendæmpning og CRISPR-baseret genredigering. Ikke desto mindre er plasmidvektorer konstrueret til dette crenarchaeon indtil videre udelukkende baseret på det kryptiske pRN2-plasmid.

Undersøgelsen, der vises i mLife , blev ledet af Prof. Qunxin She og Dr. Guanhua Yuan, begge fra Shandong University i Qingdao, Kina.

"Der kræves et dobbelt værtsvektorsystem for at berige den genetiske værktøjskasse for denne arkæonmodel," siger prof. Hun.

Faktisk på et tidligt stadium af arkæal vektorudvikling, både pRN1- og pRN2-plasmider, der eksisterer sammen i Sa. islandicus REN1H1 blev anvendt til at konstruere shuttle-vektorer for Sa. islandicus REY15A baseret på disse to plasmider; pRN2-afledte plasmider opnåede en høj transformationshastighed og gav ægte transformanter, mens pRN1-baserede vektorer kun gav meget få kolonier, hvorfra plasmider tilsyneladende var fraværende.

"Da CRISPR-arrays ofte bærer spacere, der matcher forskellige plasmider i Sulfolobales, havde vi mistanke om, at genomet af Sa. islandicus REY15A kunne bære en spacer, der matcher en sekvens i pRN1, men ikke i pRN2," siger Dr. Yuan.

Efter bestemmelse af den komplette genomsekvens af Sa. islandicus REY15A4, bærer værtsgenomet en spacer (L2S56), der kun viser to fejlparringer til et DNA-segment (Target N1) i den kodende sekvens af pRN1-replikasegenet. Transformationseffektivitetseksperimenter viste, at L2S56 crRNA'er blev udtrykt til et niveau, der kunne være tilstrækkeligt til at fremkalde I-A-immuniteten, men utilstrækkeligt til at udløse III-B-immuniteten til plasmideliminering i Sa. islandicus REY15A.

For at opnå et funktionelt mål-N1-derivat, der unddrager sig CRISPR-værtens immunitet, designede holdet tre DNA-segmenter (N1a, N1b og N1c) baseret på pRN1-målet, mens de designet mutationer i N1a var synonyme, N1b og N1c havde missense-mutationer. Resultaterne viste, at ingen af ​​de tre muterede mål blev målrettet af CRISPR-systemet i den arkæale vært. Efterfølgende eksperimenter viste imidlertid, at N1c bærer de missense-mutationer, der kan have inaktiveret replikationsproteinet.

Gennem konstruktionen af ​​en række vektorer, Saccharolobus-E. coli-shuttlevektor pN1dAA med N1a-mutationerne, argD-selektionsmarkør, p15A-replikationsstartsted og en kanamycin-resistent markør blev designet baseret på pRN1-rygraden, som kan opnå en stabil sameksistens med det pRN2-afledte plasmid pSeSD i Sa. islandicus REY15A celler. Dette gav et dobbelt plasmidsystem til genetisk undersøgelse med denne vigtige arkæiske model.

Da undersøgelse af vært-plasmid-konflikter giver et nyttigt middel til identifikation af kompatible plasmid-vektor-systemer, så snart konflikten er løst eksperimentelt, er de konstruerede plasmider meget nyttige til at udvikle vært-vektor-systemer, som rapporteret i denne artikel.

Flere oplysninger: Pengpeng Zhao et al., Rationelt design af ubegrænsede pRN1-derivater og deres anvendelse i konstruktionen af ​​et dobbelt plasmidvektorsystem for Saccharolobus islandicus, mLife (2024). DOI:10.1002/mlf2.12107

Leveret af Tsinghua University Press