Udvinding af genomisk DNA:nøgleforskelle mellem plante- og dyreceller

yacobchuk/iStock/GettyImages

Oversigt

Dobbeltstrenget DNA er det genetiske plan i enhver levende celle, men alligevel varierer procedurerne til isolering af genomisk DNA af høj kvalitet markant mellem dyre- og plantevæv.

Generelt ekstraktionsarbejdsgang

Cellelyse begynder med et detergent, der forstyrrer lipidmembraner og frigør kromatin fra kerne- og organelmembraner. Blandingen behandles derefter med alkohol for at udfælde DNA. Mens de grundlæggende trin er fælles, afhænger effektiviteten og renheden af det endelige produkt af den specifikke cellulære arkitektur og tilstedeværelsen af forurenende stoffer.

Særskilte cellestrukturer

Planteceller har en stiv cellevæg bestående af cellulose, hemicellulose og pektin og indeholder kloroplaster, der genererer en række sekundære metabolitter. Mange plantegenomer er polyploide, hvilket øger både DNA-mængde og kompleksitet. Dyreceller mangler en cellevæg og er afhængige af rengøringsmidler såsom natriumdodecylsulfat (SDS) for at bryde plasmamembranen.

Udfordringer til udvinding af plante-DNA

At bryde plantecellevæggen er den første forhindring. Mekanisk homogenisering eller enzymatisk fordøjelse med cellulase og pectinase fjerner barrieren. Imidlertid kan polysaccharider, phenoliske forbindelser og tanniner udfældes sammen med DNA, hvilket reducerer renheden. Omhyggelige vasketrin og brugen af buffere med højt saltindhold hjælper med at afbøde disse urenheder.

Dna-ekstraktionsovervejelser fra dyr

Leukocytter fra perifert blod er den mest almindelige kilde til animalsk genomisk DNA. Blod indeholder proteiner, lipider og celleaffald, der kan ekstraheres sammen med DNA. Den primære kontaminant er hæm, den ikke-proteinholdige del af hæmoglobin, som interfererer med nedstrøms enzymatiske reaktioner. Brug af en lyseringsbuffer til røde blodlegemer efterfulgt af en rensesøjle eller phenol-chloroform-ekstraktion fjerner hæm og forbedrer udbyttet.

Komparative DNA-egenskaber

Plantegenomer er ofte større og mere komplekse end dyregenomer, delvist på grund af genduplikation og gentagne elementer. Denne størrelsesforskel påvirker mængden af ​​krævet udgangsmateriale og kapaciteten af ​​ekstraktionsbuffere. Desuden kan tilstedeværelsen af sekundære metabolitter i planter ændre sammensætningen af basepar, hvilket påvirker PCR-amplifikation og sekventeringskvalitet.

Praktiske tips til DNA med høj renhed

• Brug RNase til at eliminere RNA-kontamination.
• Inkluder et proteasetrin for at nedbryde resterende proteiner.
• Anvend en silicabaseret søjle- eller magnetisk perlerensning for at opnå ensartede resultater.
• Kvantificer DNA med et fluorometrisk assay for at undgå overvurdering ved spektrofotometri.

Ved at skræddersy ekstraktionsprotokollen til den specifikke celletype kan forskere opnå pålideligt genomisk DNA med høj renhed, der er egnet til downstream-applikationer såsom sekventering, PCR og kloning.