Ethanols rolle i DNA-ekstraktion:Oprensning og koncentration

Af John Brennan
Opdateret 30. august 2022

TeerawatWinyarat/iStock/GettyImages

Forskere nedbryder rutinemæssigt DNA til dets nukleotidkomponenter for at analysere genetiske egenskaber eller sygdomsrisiko. Et kritisk trin i de fleste DNA-ekstraktionsarbejdsgange er brugen af ​​ethanol eller isopropanol til at isolere nukleinsyrer fra celleaffald. Da celler indeholder proteiner, lipider og andre forurenende stoffer, er målet at producere en DNA-opløsning, der er så ren som muligt.

Typiske ekstraktionsprotokoller involverer flere stadier:cellelyse, fjernelse af membranlipider og adskillelse af DNA fra proteiner, RNA og andre urenheder. To meget anvendte metoder er alkalisk lysis (til bakteriel plasmid-DNA) og phenol-chloroform-ekstraktion. I begge fremgangsmåder anvendes ethanol- eller isopropanoludfældning som et af de sidste trin. Efter præcipitation resuspenderes DNA-pillen i vand eller en buffer med lavt saltindhold.

Ethanol som et effektivt opløsningsmiddel

Ethanol og isopropanol er fuldt blandbare med vand, men deres dielektriske konstanter er markant lavere (vand =78,5; ethanol =24,3). DNA bærer en negativ ladning og tiltrækker kationer såsom Na⁺ eller K⁺. Fordi ethanol er mindre effektivt til at afskærme disse ioner, er der større sandsynlighed for, at DNA-kationkomplekserne aggregerer og udfælder.

Ethanol forbedrer DNA-koncentrationen

Ud over ladningsafskærmning reducerer ethanol opløseligheden af DNA ved at danne hydrogenbindinger med vand og begrænser derved antallet af tilgængelige vandmolekyler til at hydrere nukleinsyren. Denne dobbelte effekt får DNA til at præcipitere sammen med positive ioner, hvilket producerer en fast pellet, der er mere koncentreret end den oprindelige opløsning. Det er vigtigt, at mange co-forurenende stoffer ikke udfældes under de samme forhold, så den samlede renhed af DNA'et øges.

Nøgleovervejelser under udvinding

Ethanolvasken fjerner også forurenende stoffer med lav molekylvægt, såsom salte og rengøringsmidler. Valget af salt kan være kritisk, når du fjerner rengøringsmidler som natriumdodecylsulfat (SDS). For eksempel er kaliumdodecylsulfat uopløseligt og vil præcipitere, så brug af kaliumacetat i alkalisk lysis kan eliminere SDS, før ethanol eller isopropanol tilsættes. Ethanol kan også præcipitere RNA, selvom der typisk kræves en højere koncentration af ethanol for optimal RNA-genvinding.