Frekvensdomæne STED-mikroskopi til selektiv undertrykkelse af baggrundsstøj

Nanoskopi beskriver evnen til at se ud over den almindeligt accepterede optiske grænse på 200-300 nm. Stimulated emission depletion (STED) mikroskopi, udviklet af Stefan W. Hell og Jan Wichmann i 1994, og eksperimentelt demonstreret af Hell og Thomas Klar i 1999, er en superopløsningsteknik til nanoskopi. STED-mikroskopi har gjort betydelige fremskridt og er meget udbredt i praktisk forskning. Men dens praktiske brug involverer en vis uønsket baggrundsstøj, som negativt påvirker rumlig opløsning og billedkvalitet. Generelt kommer denne støj fra to signalkilder:(i) fluorescens genereret af re-excitation forårsaget af ultrahøje lysdoser fra udtømningsstrålen; og (ii) resterende fluorescens på grund af utilstrækkelig udtømning af inhiberingsstrålen.

Væsentlige metoder til fjernelse af baggrund er blevet udviklet i løbet af de sidste årtier. Disse kan opdeles i tre kategorier:tidsdomæne, rumdomæne og fasedomæne. Nogle af disse metoder er langvarige, og nogle er mere nyligt udviklet. Mens kraftfulde måder at fjerne uønsket støj fra STED-mikroskopibilleder på, indebærer de alle ulemper, herunder billedforvrængning, forlængede optagelsestider eller introduktion af skudstøj. STED-mikroskopi har endnu ikke opnået sit fulde potentiale.

Som rapporteret i Avanceret fotonik , udviklede forskere fra Zhejiang University for nylig en ny metode kaldet "dual-modulation difference" STED (dmdSTED) til at undertrykke baggrunde selektivt og effektivt. Metoden fungerer ved at sortere rumdomænesignaler i frekvensdomænet, således at den ikke-udtømte fluorescens og STED-inducerede baggrund bekvemt adskilles fra de ønskede fluorescerende signaler. Excitations- og udtømningsstrålerne belastes henholdsvis med forskellige tidsdomænemodulationer. Da den undgår re-excitation forårsaget af udtømningsstrålen, kan en udtømningslaser med en bølgelængde tættere på toppen af ​​prøvens fluorescensemissionsspektrum vælges, hvilket reducerer den nødvendige udtømningsintensitet.

Den nuværende version af dmdSTED udfører med rumlig opløsning på λ/8, højere opløsning end fasedomænemetoderne (f.eks. SPLIT, λ/5), som er tilbøjelige til skudstøj. Teoretisk set kan potentielt signaltab ved tidsdomænetilgange (som time-gating) undgås ved denne tilgang. Derudover er dmdSTED kompatibel med enten pulserede eller kontinuerlige bølgescenarier, og hardware til tidskorreleret enkeltfotontælling (TCSPC) er ikke påkrævet. Sammenlignet med rumdomænemetoder er tidsopløsningen af ​​dmdSTED ikke begrænset. DmdSTED er således fordelagtig ved optagelse af omfattende fine mikroskopiske billeder, i rumlig opløsning, SNR og tidsopløsning.

Ifølge seniorforfatter Xu Liu, direktør for State Key Laboratory of Modern Optical Instrumentation, "Denne frekvensdomænemetode har et stort potentiale til at integreres i andre dual-beam punktscanningsteknikker, såsom excited state saturation microscopy (ESSat), ladningstilstand udtømningsmikroskopi (CSD), grundtilstandsudtømningsmikroskopi (GSD) osv. Derudover kan den acceptere flere typer prøver med spektrale karakteristika, der er forskellige fra almindeligt anvendte fluorescerende farvestoffer i STED, såsom nogle kvanteprikker med et bredere excitationsspektrum. " + Udforsk yderligere

Baggrundsundertrykkelse til lysmikroskopi med superopløsning