Et-trins proteinoprensning opnår høje udbytter, renhed og aktivitet

En ny metode til at forbedre det høje udbytte, høj renhed, højaktivitetsoprensning af komplekse proteiner med 10 til 500 gange er blevet udviklet ved University of Alabama i Birmingham.

"Denne nye metode giver en række afgørende fordele for både forskere og medicinalindustrien, " sagde Dmitry Vassylyev, professor i biokemi og molekylær genetik ved UAB. "Det er potentielt det mest effektive og universelle værktøj til high-throughput undersøgelser af mange betydelige biologiske systemer og kan hjælpe med storskala produktion af terapeutiske proteiner."

Højt udbytte, høj renhed, højaktiv rensning, eller HHH, er den hellige gral til strukturelle og industrielle applikationer. UAB enkelttrins rensningsskema overvinder væsentlige svagheder ved nuværende kommercielt tilgængelige rensningssystemer, Vassylyev siger.

I et blad udgivet i Proceedings of the National Academy of Sciences , Vassylyev og UAB-kolleger testede deres CL7/Im7 affinitetskromatografioprensningsmetode på fem traditionelt udfordrende biologiske molekyler, herunder prokaryote og eukaryote membranproteiner og multisubunit DNA/RNA-bindende proteiner.

"En bemærkelsesværdig illustration af den overlegne ydeevne af CL7/Im7-tilgangen, " skrev de i PNAS-rapporten, "er det CNX-proteinprøven, som vi rensede på få timer og fra kun et par gram E. coli-celler, ville have en markedsværdi på omkring $400, 000, i henhold til aktuelle kommercielle priser."

Systemet er enkelt og genbrugeligt - UAB-forskerne har gendannet og genbrugt deres affinitetskromatografikolonne mere end 100 gange, opretholde næsten 100 procent bindingskapacitet.

Metoden er baseret på den bemærkelsesværdigt stærke bindingsaffinitet mellem bakterielle toksiner kaldet coliciner og deres specifikke immunitetsproteiner. En værtsbakterie kan frigive et colicintoksin - såsom Colicin E7 DNAse - der er i stand til at dræbe andre bakterier. Inde i værtsbakterierne, CE7 er bundet med immunitetsprotein 7, eller Im7; denne binding forhindrer selvforskyldt ødelæggelse.

Bindingsaffiniteten af ​​CE7/Im7 er næsten lige så stærk som en kovalent binding, og det er fire til syv størrelsesordener højere end andre affinitetskromatografianaloger. Vassylyev og kolleger lavede en inaktiv variant af CE7, kaldet CL7, som ikke har nogen DNase-aktivitet, men bevarer fuld bindingsaffinitet for Im7. De lavede også en variant af Im7, der muliggør effektiv kobling til agaroseperler.

Ved hjælp af genetiske teknikker, CL7-tagget indsættes let i gener fra målproteiner, i både eukaryoter og prokaryoter. Disse gener kan flyttes til en ekspressionsvektor, eller det mærkede målprotein kan udtrykkes fra native celler uden amplifikation.

Når et råproteinlysat hældes gennem en søjle fyldt med Im7-agaroseperlerne, CL7-mærkerne på målproteinet binder til Im7. Et konstrueret proteasested anvendes til at frigive målproteinet fra det bundne CL7-mærke. Dette muliggør et-trins HHH-rensning, med 97 til 100 procent renhed, for målproteinerne testet af UAB-forskerne.

I modsætning, de fleste offentliggjorte oprensningsskemaer for disse udfordrende proteiner er flertrins, flerdages protokoller, med lavere udbytte. Vassylyev, en proteinkrystallograf, siger at få store mængder rent protein er det hastighedsbegrænsende trin i krystallografi, fik ham til at begynde at søge efter en bedre metode for fire år siden.

De udfordrende proteiner, der blev oprenset i PNAS-rapporten, var bakteriel Thermus thermophilus RNA-polymerase og Mycobacteria tuberculosis RNA-polymerase, som er multisubunit proteiner; YidC membran integrase, et Bacillus halodurans membranprotein; calnexin, eller CNX, et humant transmembran chaperonprotein; og to nukleinsyrebindende proteiner, multisubunit kondensinproteinkomplekset af Salmonella typhimurium, der folder og komprimerer cellulært DNA, og det menneskelige ombygnings- og afstandsfaktorkompleks, RSF, som er impliceret i at mediere nukleosomsamling.

Det simple oprensningssystem er også anvendeligt til pulldown-eksperimenter og kinetisk aktivitet eller bindingsassays, såsom overflade plasmon resonans. Det kan også hjælpe med kryo-elektronmikroskopi.