Fremgangsmåder til vækst af store proteinkrystaller til neutronproteinkrystallografi

Evnen til at dyrke store proteinkrystaller er den største enkeltstående flaskehals, der begrænser brugen af ​​neutronproteinkrystallografi i strukturel biologi. Proteinkrystaller skal have volumener i området på mindst 0,1 mm ³ . Teoretisk er der ingen særlig grund til, at krystaller af denne størrelse ikke kan dyrkes. Hvis de kan være, neutronproteinkrystallografi kan give afgørende information om placeringen af ​​hydrogenatomer detaljer relateret til hydreringshydrogenbinding og ligandinteraktioner. Denne type information er af direkte relevans for akademisk og farmakologisk drevet forskning inden for biovidenskab.

Udfordringen er således at opnå stor krystalvækst i en reproducerbar, tidsbesparende, arbejdsbesparende måde. Det ville være ideelt, hvis i fremtiden, neutronkrystallografer kan, efter passende prækarakteriseringsarbejde, indsende deres løsninger til en automatiseret eller semi-automatiseret platform, der ville give mulighed for at udforske en lang række forhold på en meget systematisk måde og give brugerne mulighed for at overvåge væksten fra deres fjerncomputere.

Ashley Jordan ved Institut Laue-Langevin (ILL) i Grenoble, Frankrig, har undersøgt to nye krystalvækstmetoder:udviklingen af ​​et modul, der kunne tillade større automatiserede tilgange i fremtiden (opgave 1), og et flow-krystallisationssystem (opgave 2).

Opgave 1:Et modul til automatiseret udforskning af store krystalvækst

Dette SINE2020-projekt har fokuseret på udviklingen af ​​et temperaturkontrollerbart multibrøndsmodul, hvor krystalvækst kan optimeres. Ideen med at designe dette modul var at opskalere tilgangen, så flere krystallisationsbrønde med individuel (programmerbar) temperaturkontrol kunne bruges til at udforske en bred vifte af vækstbetingelser. Der blev lavet et prototypemodul, der bestod af et specialdesignet pladedesign indeholdende 6 × 4 brønde, hvor de individuelle krystallisationsforsøg kan forekomme. Hver brønd kan tilpasses forskellige forhold, hvor hver har uafhængig temperaturkontrol. Brøndene opvarmes ved hjælp af Peltier-varmeelementer med et temperaturfeedback-system, der gør det muligt at opvarme og afkøle hver brønd over et temperaturområde på 4 grader C til 60 grader C, med en nøjagtighed på 0,1 grad. Opsætningen blev designet til at tillade krystalvækst at blive overvåget og optaget fotografisk.

Ashley Jordan, Ryo Mizuta og John Allibon (som udviklede softwaren) har bygget og testet prototypesystemet. Krystallisationstests er blevet udført med trypsin og rubredoxin.

Post-SINE2020, ideen ville være at få disse moduler til at "plug and play", så en mere udvidet 'robotisk' tilgang kunne bruges. Krystallogenese-kørsler kunne fjernes af brugeren, når de er færdige, og andre kørsler kan installeres ved hjælp af et andet modul – modulet ville være arbejdsenheden i et større array – alle kan kameravisualiseres og give time-lapse-information til en brugerportal.

Opgave 2:Flowkrystallisation

En anden måde at forfølge stor krystalvækst på er ideen om et flowkrystallisationssystem. Ideen er at opretholde steady-state batch-forhold omkring en krystal på alle tidspunkter under dens vækst, ved at tilvejebringe en konstant forsyning af frisk proteinstam til krystallisationsmiljøet. Dette vil opretholde optimale opløsningsforhold til enhver tid og hjælpe med at minimere ophobning af urenheder på krystaloverflader - sådanne urenheder kan hindre krystalvækst.

En Dolomite Mitos P-pumpe blev valgt for at opretholde den ekstremt lave flowhastighed (mellem 70-1500 nl min-1), der kræves for at regulere systemet. Et passende krystallisationskammer, der kan forbindes til pumpen, blev designet og fremstillet ved hjælp af en 3-D-printer. Dette kammer skaber et forseglet miljø og giver let adgang til krystallerne, når de er vokset.