Ny eksperimentel indsigt giver forskere mulighed for at undersøge protein-DNA-interaktioner med større præcision

En billedteknik med et enkelt molekyle, kaldet proteininduceret fluorescensforbedring (PIFE), har vundet indpas i de senere år som et populært værktøj til at observere DNA -protein -interaktioner med nanometerpræcision. Endnu, ifølge en ny KAUST -undersøgelse, forskningslaboratorier har ikke brugt teknikken til sit fulde potentiale.

PIFE -analysen er baseret på ideen om, at DNA mærket med et fluorescerende farvestof vil lyse lysere, når proteiner bindes i nærheden. I mange tilfælde, dette er sandt-hvilket har fået mange forskere til at vedtage PIFE frem for andre mere arbejdskrævende teknikker, der er afhængige af dobbelt mærkning af proteiner og DNA.

Men Samir Hamdans kandidatstuderende Fahad Rashid, Manal Zaher og Vlad-Stefan Raducanu indså, at proteinbinding til DNA-farvestofkomplekser undertiden også kunne have den modsatte effekt. I stedet for at forstærke det fluorescerende signal, proteininteraktioner kan undertiden dæmpe gløden, afhængigt af visse egenskaber ved systemet.

Hamdan krediterer sine elevers nysgerrighed for at have foretaget denne observation og detaljeret hvordan den fungerer. Inspiration fra Rashids tidligere arbejde førte teamet til det fænomen, de kalder proteininduceret fluorescens quenching (PIFQ). Og som Rashid forklarer, "Vi satte os for bedre at definere de forhold, der fører til fluorescerende bomme eller buster."

Gennem en kombination af eksperimentelle og beregningsmæssige analyser, KAUST-teamet viste, at den indledende fluorescens-tilstand af DNA-farvestofkomplekset bestemmer, om PIFE eller PIFQ vil resultere efter proteinbinding. Uden denne viden, sandsynligheden for, at begge hændelser bliver ækvivalent med et møntkast, som kan bringe den mekanistiske fortolkning af laboratorieresultater i fare.

"Når indsigt i denne indledende tilstand hentes fra fluorescens og strukturarbejde, forventningen om begge effekter bliver eksperimentelt mulig, ”Forklarer Raducanu.

Faktorer, såsom DNA -sekvens og farvestofposition, kan tippe balancen mod PIFE eller PIFQ; KAUST-teamet blev så gode til at fortolke den molekylære kode, at de nøjagtigt kunne forudsige, hvad der ville ske ved blot at måle, hvordan disse parametre påvirker den indledende fluorescenstilstand i DNA-farvestoffesystemet.

"Vi gjorde hver måling til et spil, "Zaher siger, "og vi er glade for at sige, at vores hypotese forudsagde resultatet mere end 90 procent af tiden!"

Disse nye indsigter skulle dramatisk udvide rækkevidden og det eksperimentelle løfte om dette kraftfulde billedværktøj til enkeltmolekyler, forudser Raducanu. "Ved at introducere PIFQ, vi tilbyder forskere inden for området mulighed for at behandle flere biologiske spørgsmål, hvor PIFE muligvis ikke var vidne til, " han siger.

Forskere kan også vælge at kombinere PIFE og PIFQ for at dechifrere processer med flere trin og multiprotein med kun en enkelt DNA-farvestofkonstruktion.

"Under hensyntagen til den kontekstafhængige karakter af fluorescensmodulation i DNA-farvestofsystemet åbner døren for mange muligheder i eksperimentelt design, der kan skræddersys til forskeres behov, "Siger Zaher.

"Vi forventer nu, at fortolkning af data og tilskrivning af molekylære begivenheder fra enkeltmolekylære data bliver lettere og mere præcis, "Tilføjer Rashid.