Enzymcocktail udviklet i Brasilien driver produktionen af ​​anden generations ethanol

Forskere ved det brasilianske center for forskning i energi og materialer (CNPEM) har genetisk manipuleret en svamp til at producere en cocktail af enzymer, der nedbryder kulhydraterne i biomasse, såsom affald fra sukkerrør (toppe og blade) og bagasse, til gærbart sukker til industrielt effektiv omdannelse til biobrændstof.

Udviklingen af ​​billige enzymcocktails er en af ​​de største udfordringer ved fremstilling af anden generations ethanol.

Andengenerations biobrændstoffer fremstilles af forskellige former for ikke-fødevarebiomasse, herunder landbrugsrester flis og spildolie. CNPEM -forskningsgruppens proces baner vejen for optimeret brug af sukkerresterester til produktion af biobrændstoffer.

Svampen Trichoderma reesei er en af ​​de mest produktive producenter af plantecellevægtsnedbrydende enzymer og bruges meget i bioteknologiindustrien. For at øge produktiviteten som biofaktor for den pågældende enzymcocktail, forskerne introducerede seks genetiske modifikationer i RUT-C30, en offentligt tilgængelig stamme af svampen. De patenterede processen og rapporterede det i en artikel, der blev offentliggjort i tidsskriftet Bioteknologi til biobrændstoffer .

"Svampen blev rationelt modificeret for at maksimere produktionen af ​​disse enzymer af bioteknologisk interesse. Ved hjælp af genredigeringsmetoden CRISPR/Cas9, vi modificerede transkriptionsfaktorer for at regulere ekspressionen af ​​gener forbundet med enzymerne, slettede proteaser, der forårsagede problemer med enzymcocktailens stabilitet, og tilføjede vigtige enzymer, svampen mangler i naturen. Som resultat, vi var i stand til at lade svampen producere en stor mængde enzymer fra agroindustrielt affald, et billigt og rigeligt råstof i Brasilien, "Mario T. Murakami, Videnskabelig direktør for CNPEM's Biorenewables Laboratory (LNBR), fortalte Agência FAPESP.

Ca. 633 millioner tons sukkerrør forarbejdes pr. Høst i Brasilien, årligt at producere 70 millioner tons sukkerrør (tør masse), ifølge National Food Supply Company (CONAB). Dette affald er underudnyttet til produktion af ethanol i brændstof.

Murakami understregede, at praktisk talt alle de enzymer, der bruges i Brasilien til nedbrydning af biomasse, importeres fra et par udenlandske producenter, der holder teknologien under forretningshemmelig beskyttelse. I denne sammenhæng, den importerede enzymcocktail kan repræsentere hele 50% af et biobrændsels produktionsomkostninger.

"Under det traditionelle paradigme, årtiers studier var nødvendige for at udvikle en konkurrencedygtig enzymcocktailproduktionsplatform, "sagde han." Desuden cocktailsne kunne ikke udelukkende opnås ved syntetiske biologiteknikker fra offentligt tilgængelige stammer, fordi producenterne brugte forskellige metoder til at udvikle dem, såsom adaptiv evolution, udsætte svampen for kemiske reagenser, og inducering af genomiske mutationer for at vælge den mest interessante fænotype. Nu, imidlertid, takket være avancerede genredigeringsværktøjer som CRISPR/Cas9, Det er lykkedes os at etablere en konkurrencedygtig platform med blot et par rationelle ændringer på to et halvt år. "

Bioprocessen udviklet af CNPEM -forskerne producerede 80 gram enzymer pr. den højest eksperimentelt understøttede titer hidtil rapporteret for T. reesei fra et lavpris sukkerbaseret råstof. Dette er mere end det dobbelte af den koncentration, der tidligere er rapporteret i den videnskabelige litteratur for svampen (37 gram pr. Liter).

"Et interessant aspekt af denne forskning er, at den ikke var begrænset til laboratoriet, "Murakami sagde." Vi testede bioprocessen i et semi-industrielt produktionsmiljø, skalere det op til et pilotanlæg for at vurdere dets økonomiske gennemførlighed. "

Selvom platformen blev tilpasset til fremstilling af celluloseholdig ethanol fra sukkerrørrester, han tilføjede, det kan nedbryde andre former for biomasse, og avancerede sukkerarter kan bruges til at producere andre biofornyelige energikilder såsom plast og mellemkemikalier.

Ny enzymklasse

Processen var det praktiske resultat (i form af en industriel anvendelse) af omfattende forskning udført af LNBR for at udvikle enzymer, der er i stand til at nedbryde kulhydrater. I en anden undersøgelse understøttet af FAPESP og offentliggjort i Naturens kemiske biologi , forskerne afslørede syv nye enzymklasser frem for alt i svampe og bakterier.

De nye enzymer tilhører familien glycosidhydrolase (GH). Ifølge Murakami, disse enzymer har et betydeligt potentiale for anvendelser ikke kun inden for biobrændstoffer, men også inden for medicin, fødevareforarbejdning og tekstiler, for eksempel. Enzymerne vil inspirere til nye industrielle processer ved at udnytte de forskellige måder, hvorpå naturen nedbryder polysaccharider (kulhydrater, der består af mange simple sukkerarter).

Disse enzymer nedbryder beta-glucaner, nogle af de mest udbredte polysaccharider, der findes i kornets cellevægge, bakterier og svampe, og en stor brøkdel af verdens tilgængelige biomasse, angiver enzymernes potentielle anvendelse i fødevarekonserveringsmidler og tekstiler. For biobrændstoffer, den centrale egenskab er deres evne til at fordøje materiale, der er rig på vegetabilske fibre.

"Vi satte os for at studere naturens mangfoldighed i nedbrydende polysaccharider, og hvordan denne viden kan anvendes på processer i forskellige industrier, "Murakami sagde." Ud over opdagelsen af ​​nye enzymer, et andet vigtigt aspekt af denne forskning er den netværksmetode, vi bruger til at producere systematisk og dybtgående viden om denne enzymfamilie. Fremgangsmåden gjorde det muligt for os at starte forfra og på relativt kort tid, nå frem til den mest undersøgte familie af enzymer, der er aktive på beta-1, 3-glucaner til dato, med tilgængelige oplysninger om specificitet og handlingsmekanismer. "

Hovedkriteriet for klassificering af enzymer er normalt fylogeni, dvs. molekylets evolutionære historie, der henviser til, at CNPEM -forskere fokuserer på funktionalitet.

"Takket være fremskridt inden for DNA -sekventeringsteknologi, vi har nu mange kendte genetiske sekvenser og en veletableret evne til at studere og karakterisere molekyler og enzymer med hensyn til deres funktionalitet. Som resultat, vi har været i stand til at forfine lighednetværksmetoden og bruge den for første gang til at studere enzymer, der er aktive på polysaccharider, "Sagde Murakami.

Ved hjælp af netværksmetoden til lighed, gruppen klassificerede syv underfamilier af enzymerne baseret på funktionalitet. Kendetegner mindst et medlem af hver underfamilie, forskerne fik systematisk adgang til mangfoldigheden af ​​molekylære strategier til nedbrydning af beta-glukaner, der er indeholdt i tusinder af medlemmer af enzymfamilien.

Biokemisk tour de force

Fylogenetisk analyse fokuserer på DNA -regioner, der er bevaret over tid, der henviser til, at klassificering efter funktionalitet er baseret på ikke -konserverede regioner, der er forbundet med funktionel differentiering. "Dette gav os effektivitet og gjorde det muligt for os at gruppere mere end 1, 000 sekvenser i kun syv undergrupper eller klasser med samme funktion, "Sagde Murakami.

Fordi tilgangen var ny, forskerne udførte flere andre undersøgelser for at dobbelttjekke og validere klassificeringsmetoden. Fra de syv grupper af enzymer, der er i stand til at nedbryde polysaccharider, de opnåede 24 helt nye strukturer, herunder forskellige substrat-enzymkomplekser, anses for afgørende for at give oplysninger for at forstå de involverede handlingsmekanismer.

Undersøgelsen omfattede funktionelle og strukturelle analyser for at forstå, hvordan disse enzymer virker på de pågældende kulhydrater. "Polysaccharider findes i snesevis af konfigurationer og er i stand til mange slags kemiske bindinger, "Murakami sagde." Vi ville observere præcis, hvilke kemiske bindinger og arkitekturer der genkendes af hvert enzym. Af denne grund, det måtte være et tværfagligt studie, kombinerer strukturelle og funktionelle data understøttet af analyse ved hjælp af massespektrometri, spektroskopi, mutagenese og diffraktionsforsøg for at belyse atomstrukturen. "

I afsnittet "Nyheder og visninger" i det samme nummer af Naturens kemiske biologi , Professor Paul Walton, Formand for bio -organisk kemi ved University of York i Det Forenede Kongerige, vurderede glycosidhydrolasestudiet til en "biokemisk 'tour de force'" for sin innovative tilgang og roste dens "enorme indsigt", tilføjede, at forskerne var "i stand til at udtrykke og isolere eksemplarer fra hver klasse [af enzymer] for at undersøge, om forskellene i sekvenser mellem klasserne afspejles i deres strukturer og aktiviteter".