Almindelig brugt kemisk fiksering forårsager aggregeringsartefakter

Forskere ved Kanazawa University rapporterer i Communications Biology at brug af almindelige kemikalier til fiksering af levende celleprøver til mikroskopiundersøgelser får membranproteiner til at aggregere.

Til histologiske undersøgelser af biologiske væv, dvs. anatomiske undersøgelser under mikroskop, fikseres prøver sædvanligvis for at forhindre dem i at henfalde. Fiksering udføres typisk ved nedsænkning eller perfusion af prøven i et kemikalie - aldehyder og alkoholer er almindelige fikseringsmidler. Det er blevet spekuleret i, at membranproteiner, der bevæger sig til en vis grad på en cellemembran, kan danne aggregater under fiksering. Alligevel er detaljerede celleoverfladeundersøgelser med opløsning i nanometerskala nødvendige for at opnå endelig indsigt i dette potentielle problem. Nu har Takehiko Ichikawa og kolleger fra Kanazawa University udført atomic force microscopy (AFM) undersøgelser af levende pattedyrs celleoverflader. Ved at sammenligne ikke-fikserede og fikserede prøver fandt de ud af, at fiksering faktisk fører til strukturelle ændringer.

Forskerne udviklede en metode til at bruge mikroporøs siliciumnitridmembran (MPM), der bruges i transmissionselektronmikroskopi (figur 1), til AFM-billeddannelse. Det er vigtigt, at MPM kan gøre celleoverfladen flad og forhindre udsving ved at støtte området uden for observationsområdet. I AFM-billeder af overfladerne af de dyrkede tyktarmskræftceller på MPM viste biomolekylære strukturer på cellemembranerne sig som fremspring med en typisk størrelse på nogle få nanometer (Figur 2 levende celleoverflade).

Når cellerne blev behandlet med almindeligt anvendte fikseringsmidler såsom paraformaldehyd, glutaraldehyd og methanol, forsvandt nogle få nanometerstrukturer, og der blev kun observeret store fremspring med diametre fra 20 til 100 nanometer (figur 2). Forskerne udførte adskillige fluorescenseksperimenter og konkluderede, at store fremspring observeret efter fiksering blev dannet ved aggregering af membranproteiner.

Undersøgelsen viser, at de observerede aggregater er artefakter, der er et resultat af fikseringsprocessen. Dette bør kræve forsigtighed blandt samfundet af forskere, der arbejder med kemiske fikseringsmidler. Citerer Ichikawa og kolleger:"Forskere, der observerer nanoskala klynger bør også være forsigtige med at fortolke deres eksperimentelle resultater, når de bruger fikserede celler. Vi anbefaler, at forskere bruger levende celler så meget som muligt for at undgå effekten af ​​fiksering, når de undersøger nanoskala klynger." P>

Det generelle princip bag atomkraftmikroskopi (AFM) er at få en meget lille spids til at scanne overfladen af ​​en prøve. Under denne vandrette (xy) scanning følger spidsen, som er fastgjort til en lille cantilever, prøvens lodrette (z) profil, hvilket inducerer en kraft på cantileveren, som kan måles. Størrelsen af ​​kraften ved xy-positionen kan relateres til z-værdien; xyz-dataene genereret under en scanning resulterer derefter i et højdekort, der giver strukturel information om den undersøgte prøve. AFM er ikke påvirket af diffraktionsgrænsen på grund af brugen af ​​lys eller elektronstråler og kan observere den intakte overfladetopografi med høj opløsning. + Udforsk yderligere

Tildeling af bevægelige funktioner i højhastigheds atomkraftmikroskopi