Ny metode muliggør effektiv prøveforberedelse til enkeltcellet proteomik

Proteinerne, der udgør vores celler, rummer en hel verden af ​​information, som, når de er låst op, kan give os indsigt i oprindelsen af ​​mange væsentlige biologiske fænomener. Denne information indsamles ved hjælp af en analytisk teknik kendt som "enkeltcellet proteomik", hvor en enkeltcelleanalyse udføres for at observere individuelle cellers egenskaber på deres proteinniveau. I årenes løb har forskere brugt enkeltcellet proteomik inden for cancergenomik, celledifferentiering og vævsudvikling. Nuværende proteomiske teknikker lider imidlertid af lav genvindingshastighed af proteinprøver, lav gennemstrømning og mangel på alsidighed.

Heldigvis har et team af forskere fra Japan og USA ledet af adjunkt Takeshi Masuda fra Kumamoto University i Japan fundet en løsning på disse problemer. I en nylig undersøgelse gjort tilgængelig online den 11. juli 2022 og offentliggjort i Analytical Chemistry den 26. juli 2022 introducerede holdet en enkel, men yderst effektiv prøveforberedelsesmetode til enkeltcellet proteomik kaldet "vanddråbe-i-olie-metoden" (WinO). Teknikken bruger vands blandbarhed med olie/organisk opløsningsmiddel til sin fordel til at forberede proteinprøver med minimalt tab og øgede chancer for prøvegenvinding.

"For at gøre enkeltcelle-proteomik mere effektiv skal vi enten amplificere proteinprøven eller sikre os, at intet af det går tabt under prøveforberedelsen. Da vi ikke havde midlerne til at gøre førstnævnte, var det afgørende, at vi reducerede absorptionen tab under prøveforberedelsestrin som prøveoverførsel," forklarer Dr. Masuda. "WinO-teknikken reducerer ikke kun prøvetab gennem adsorption, men giver også bedre gennemløb sammenlignet med konventionelle metoder."

Til WinO-processen forberedte holdet først en ekstraktionsbuffer ved at blande en mikroliter vand med faseoverførselsoverfladeaktive stoffer (som øger opløseligheden af ​​hydrofobe proteiner) og hydrofobe carboxyl-coatede nanomagnetiske perler. Denne blanding blev derefter tildryppet i 50 mikroliter ethylacetat.

Det næste trin var proteinekstraktion, som blev udført ved at tilføje celledråber fra cellesorteringsapparatet til ethylacetat-vanddråbekombinationen og spinde den i en centrifuge for at tillade proteinet at akkumulere i vanddråben. Efter ekstraktionen blev prøven fordøjet under anvendelse af et proteinenzym, Lys-C, og mærket under anvendelse af et "tandem massemærke"-reagens. Den ekstraherede-fordøjede-mærkede prøve blev derefter oprenset og genvundet til enkeltcelleanalyse og proteomiske profiler.

For at sammenligne effektiviteten af ​​WinO-metoden med konventionelle metoder, forberedte holdet også prøver ved hjælp af standard in-solution digestion (ISD)-metoden og udførte proteomisk analyse. De fandt ud af, at WinO-metoden førte til en 10-fold stigning i protein- og peptidgenvinding sammenlignet med ISD. Denne bemærkelsesværdige forbedring blev tilskrevet et reduceret kontaktareal mellem ekstraktionsopløsningen og prøvebeholderen.

For at analysere følsomheden af ​​begge metoder sammenlignede holdet også de opnåede proteomiske profiler. De observerede en høj korrelation mellem proteomiske profiler opnået for 100 celler ved hjælp af WinO og det for 10.000 celler ved hjælp af ISD. Desuden kvantificerede holdet med succes 462 proteiner ved hjælp af WinO, hvilket viste, at det gav en meget højere gennemløbs- og ekstraktionseffektivitet end konventionelle teknikker.

Den forbedrede proteingenvinding og -identifikationsevne, som WinO giver, kunne muliggøre et nærmere kig på proteinekspressionen af ​​kræftceller og en bedre forståelse af de mekanismer, der ligger til grund for resistens mod kræftlægemidler. Ydermere kan WinO være semi-automatiseret ved hjælp af en væskehåndteringsrobot, hvilket gør den velegnet til højhastighedsbehandling med stor kapacitet af prøver. "Vores forskning kunne give forskere mulighed for at udføre proteomik på sjældne og begrænsede prøvemængder samt give et nyt perspektiv på proteinekspression, hvilket åbner muligheder for at opdage nye biologiske fænomener," konkluderer Dr. Masuda. + Udforsk yderligere

Hurtig og nem proteinanalyse fra spormængder af celleprøver