Team rekonstruerer nanoskala virusfunktioner fra korrelationer mellem spredte røntgenstråler

Som en del af et internationalt forskerhold, Jeff Donatelli, Peter Zwart og Kanupriya Pande fra Center for Advanced Mathematics for Energy Research Applications (CAMERA) ved Lawrence Berkeley National Laboratory (Berkeley Lab) bidrog med vigtige algoritmer, som hjalp med at nå et mål, der først blev foreslået for mere end 40 år siden - ved hjælp af vinkelkorrelationer af røntgenstråler øjebliksbilleder fra ikke-krystallinske molekyler for at bestemme 3D-strukturen af ​​vigtige biologiske objekter. Denne teknik har potentiale til at give forskere mulighed for at kaste lys over biologisk struktur og dynamik, der tidligere var umulig at observere med traditionelle røntgenmetoder.

Gennembruddet skyldtes et enkeltpartikel-diffraktionsforsøg udført på Department of Energy's (DOE's) Linac Coherent Light Source (LCLS) af Single-Particle Initiative arrangeret af SLAC National Accelerator Laboratory. Som en del af dette initiativ, CAMERA -teamet kombinerede indsatsen med Ruslan Kurta, en fysiker ved den europæiske XFEL (røntgenfri elektronlaser) facilitet i Tyskland, at analysere vinkelkorrelationer fra de eksperimentelle data og bruge CAMERAs multi-tiered iterative phasing (M-TIP) algoritme til at udføre de første vellykkede 3D-virusrekonstruktioner fra eksperimentelle korrelationer. Resultaterne blev beskrevet i et papir, der blev offentliggjort 12. oktober i Fysisk gennemgangsbreve .

"I de sidste 40 år har dette blev betragtet som et problem, der ikke kunne løses, "sagde Peter Zwart, medforfatter på papiret og en fysisk bioscientist, der er medlem af CAMERA baseret på Molecular Biophysics and Integrated Imaging Division på Berkeley Lab. "Men det viser sig, at de matematiske værktøjer, som vi udviklede, er i stand til at udnytte ekstra information, der er skjult i det problem, der tidligere var blevet overset. Det er glædeligt at se vores teoretiske tilgang føre til et praktisk værktøj."

Nye forskningsmuligheder aktiveret af XFEL'er

I store dele af det sidste århundrede, go-to-teknikken til bestemmelse af højopløselig molekylær struktur har været røntgenkrystallografi, hvor prøven af ​​interesse er arrangeret i et stort periodisk gitter og udsat for røntgenstråler, der spredes ud og danner diffraktionsmønstre, der opsamles på en detektor. Selvom krystallografi har haft succes med at bestemme mange strukturer i høj opløsning, det er udfordrende at bruge denne teknik til at studere strukturer, der ikke er modtagelige for krystallisering eller strukturelle ændringer, der ikke naturligt forekommer i en krystal.

Oprettelsen af ​​XFEL -faciliteter, herunder Linac Coherent Light Source (LCLS) og den europæiske X-FEL, har skabt muligheder for at udføre nye eksperimenter, som kan overvinde begrænsningerne ved traditionel krystallografi. I særdeleshed, XFEL-stråler er flere størrelsesordener lysere end og har meget kortere pulslængder end traditionelle røntgenlyskilder, som giver dem mulighed for at indsamle målbart diffraktionssignal fra mindre ukrystalliserede prøver og også studere hurtig dynamik. Enkeltpartikeldiffraktion er en sådan ny eksperimentel teknik, der aktiveres af XFELS, hvor man indsamler diffraktionsbilleder fra enkelte molekyler i stedet for krystaller. Disse enkeltpartikelteknikker kan bruges til at studere molekylær struktur og dynamik, der har været svære at studere med traditionelle billeddannelsesteknikker.

Overvindelse af begrænsninger i enkeltpartikel-billeddannelse via vinkelkorrelationer

En stor udfordring ved enkeltpartikel-billeddannelse er orienteringsbestemmelsen. "I et enkeltpartikeleksperiment, du ikke har kontrol over partiklernes rotation, da de bliver ramt af røntgenstrålen, så hvert øjebliksbillede fra et vellykket hit vil indeholde oplysninger om prøven fra en anden retning, "sagde medforfatter Jeff Donatelli, en anvendt matematiker i CAMERA, der udviklede mange af algoritmerne i de nye rammer. "De fleste tilgange til enkeltpartikelanalyse har hidtil været baseret på at forsøge at bestemme disse partikelorienteringer ud fra billederne; den bedste opløsning, der kan opnås ved hjælp af disse analyser, er begrænset af, hvor præcist disse orienteringer kan bestemmes ud fra støjende data. "

I stedet for at forsøge at bestemme disse retningslinjer direkte, holdet tog en anden tilgang baseret på idé, der oprindeligt blev foreslået i 1970'erne af Zvi Kam. "I stedet for at undersøge de individuelle dataintensiteter i et forsøg på at finde den korrekte orientering for hver målt ramme, vi eliminerer dette trin helt ved hjælp af såkaldte krydskorrelationsfunktioner, "Sagde Kurta.

Denne tilgang, kendt som fluktuationsrøntgenstråling, er baseret på at analysere vinkelsammenhængene mellem ultrakort, intense røntgenpulser spredt fra ikke-krystallinske biomolekyler. "Det smukke ved at bruge korrelationsdata er, at det indeholder et omfattende fingeraftryk af 3D -strukturen af ​​et objekt, der udvider traditionelle løsningsspredningsmetoder, "Sagde Zwart.

Rekonstruktion af 3D-struktur fra korrelationer med CAMERAs M-TIP-algoritme

Teamets gennembrud i rekonstruering af 3D-struktur ud fra korrelationsdata blev muliggjort af multi-tiered iterative phasing (M-TIP) algoritmen udviklet af CAMERA. "Blandt de fremtrædende fordele ved M-TIP er dets evne til at løse strukturen direkte fra korrelationsdata uden at skulle stole på nogen symmetribegrænsninger, og, vigtigere, uden behov for at løse orienteringsbestemmelsesproblemet, "Sagde Donatelli.

Donatelli, CAMERA-direktør James Sethian og Zwart udviklede deres M-TIP-ramme ved at udvikle en matematisk generalisering af en klasse algoritmer kendt som iterative faseteknikker, som bruges til at bestemme struktur i et enklere problem, kendt som fasehentning. Et papir, der beskriver de originale M-TIP-rammer, blev offentliggjort august 2015 i Procedurer fra National Academy of Sciences .

"Avancerede korrelationsanalyser i kombination med ab-initio-rekonstruktioner ved M-TIP definerer klart en effektiv rute til strukturel analyse af nanoskalaobjekter på XFEL'er, "Sagde Zwart.

Fremtidige anvisninger for korrelationsanalyse og M-TIP

Teamet bemærker, at metoder, der anvendes i denne analyse, også kan anvendes til at analysere diffraktionsdata, når der er mere end en partikel pr. Skud.

"De fleste algoritmer til billedbehandling med enkeltpartikler kan kun håndtere ét molekyle ad gangen, dermed begrænsning af signal og opløsning. Vores tilgang, på den anden side, er skalerbar, så vi også skal kunne måle mere end en partikel ad gangen, "sagde Kurta. Billeddannelse med mere end en partikel pr. skud vil give forskere mulighed for at opnå meget højere hitfrekvenser, da det er lettere at bruge en bred stråle og ramme mange partikler ad gangen, og vil også undgå behovet for at adskille enkeltpartikelhits fra hits med flere partikler og tomme skud, hvilket er et andet udfordrende krav i traditionel enkeltpartikel-billeddannelse.

Som en del af CAMERAs pakke beregningsværktøjer, de har også udviklet en anden version af M-TIP, som løser orienteringsproblemet og kan klassificere billederne i konformationstilstande, og kan derfor bruges til at studere små biologiske forskelle i den målte prøve. This alternate version of M-TIP was described in a paper published June 26 2017 in the Procedurer fra National Academy of Sciences and is part of a new collaboration initiative between SLAC National Accelerator Laboratory, CAMERA, the National Energy Research Scientific Computing Center (NERSC) and Los Alamos National Laboratory as part of DOE's Exascale Computing Project (ECP).