Molekylære detaljer om proteinkrystalkernen afdækket

Et team af forskere ledet af Dr. Mike Sleutel fra VIB-VUB Center for Structural Biology i samarbejde med forskere fra Institute for Complex Molecular Systems ved Eindhoven University of Technology, og CNRS i Grenoble, har for første gang afdækket de molekylære detaljer ved proteinkrystalkernen, en proces med stor medicinsk og videnskabelig relevans. Teamet udviklede også en ny metode til at studere en bred klasse af systemer, der hidtil har været undvigende. Deres resultater er offentliggjort i Natur .

Dr. Mike Sleutel (VIB-VUB):"Det vil være spændende at se denne nye teknik blive anvendt i fremtiden for at følge protein-selvmonteringsprocesser, der er impliceret i en række patologiske lidelser, såsom væske-væske-faseadskillelse ved dannelse af øjet grå stær eller dannelsen af ​​amyloidfibre forbundet med en række neurologiske lidelser. "

Proteinkrystaller har stor medicinsk og videnskabelig relevans. I årtier, de har været afgørende for strukturelle biologer til at løse de tredimensionelle strukturer af proteiner, men proteinkrystaller bruges også som biofarmaceutiske leveringsmidler. Krystallinske suspensioner er attraktive formuleringer til opbevaring og administration af aktive farmaceutiske forbindelser på grund af deres langvarige holdbarhed, lav opløsningsmiddelviskositet, og langsom opløsningshastighed. Det måske mest kendte eksempel er insulin:insulinskud omfatter subkutan injektion af en suspension af insulinmikrokrystaller, der opløses langsomt og giver en stabil og vedvarende levering over tid. På trods af deres enorme potentiale, der er to faktorer, der begrænser brugen af ​​proteinkrystaller i en bred vifte af anvendelser.

Udfordringer med at udvikle proteinkrystaller

Først, dyrkning af proteinkrystaller, som mange molekylære biologer vil sige, er mere en kunst end en videnskab. Faktisk, for mange proteiner, krystallisering kan være ulideligt svært. Dette følger delvist af det faktum, at forskere ikke forstår de tidlige stadier af proteinkrystaldannelse. Enhver krystal stammer fra en kerne, et lille krystallinsk frø, som dannes ved spontan gruppering af et par molekyler i opløsning, der skal vedtage en regelmæssig organisation i tre dimensioner. Hvordan molekylerne realiserer denne usandsynlige bedrift, har indtil nu været et mysterium.

For det andet, et enkelt protein kan krystallisere i flere forskellige krystalformer, dette er kendt som polymorfisme. Forskellige krystalpolymorfer har forskellige egenskaber, med de mest bemærkelsesværdige dem til at diffraktere røntgenstråler (afgørende for bestemmelse af 3D-struktur), og den hastighed, hvormed den opløses (afgørende for lægemiddeltilførsel). Indtil nu, det er meget vanskeligt at styre krystallisationsprocessen til den polymorf, man kan lide. Forskere mener, at udvælgelse af polymorf finder sted på nukleationsstadiet, men ingen ved præcis, hvordan mekanismen fungerer.

En ny måde at se på selvsamling af makromolekyler

Gruppen af ​​forskere under ledelse af Dr. Mike Sleutel har brugt state-of-the-art kryo-transmissionselektronmikroskopi (Cryo-TEM) til at fange fødslen af ​​en proteinkrystal ved at visualisere nukleationsprocessen ved molekylær opløsning.

Dr. Heiner Friedrich forklarer:"Fordi processen sker så hurtigt, og i en så lille længde skala havde vi brug for at kryogenisk standse prøven på forskellige stadier af processen. Når den er frosset i tide, Vi bruger et meget følsomt elektronmikroskop til at visualisere proteinerne, og hvordan de grupperer sig for at danne en kerne og til sidst proteinkrystal. "

Ved at analysere Cryo-TEM-billederne taget fra en række prøver med konstante tidsintervaller, de kunne begynde at pusle sammen serien af ​​molekylære kollisioner, der skal finde sted for at danne en krystallinsk kerne. Dr. Mike Sleutel fortsætter:"Vi blev slået af processens uventede kompleksitet, hvilket viste sig at være langt mere indviklet end de arbejdsmodeller, vi og andre inden for området havde før disse observationer. For proteinet, som vi brugte i vores undersøgelse, afdækkede vi en hierarkisk selvsamlingsproces, der involverer tre efterfølgende stadier af selvsamling i stadig større længder. "Disse observationer er de første af deres art og giver en ny måde at se på selvmonteringsprocesser af makromolekyler til større strukturer.

Men holdet gik endnu et skridt videre, og sammenlignede kimdannelsesvejene for flere polymorfer. De viste, at polymorfe selektion er dikteret af arkitekturen af ​​de mindst mulige fragmenter dannet på tidlige tidspunkter. Når sådanne strukturer først er dannet, systemets tro er sat. Dr. Alexander Van Driessche forklarer:"Ved at analysere og forstå forskellene i strukturen af ​​de forskellige kerner, vi udviklede strategier til at guide polymorfe udvælgelsesprocessen. Vi opnåede dette ved forsigtigt at justere de forskellige interaktionsformer, der eksisterer mellem molekylerne, styring af nukleeringsprocessen i den retning, vi vælger." Teamet mener, at den nye indsigt og metodologi i væsentlig grad vil fremme udviklingen af ​​proteinkrystaller til 3D-strukturbestemmelse og medicinske anvendelser.