Genteknisk mekanisme visualiseret

Forskere ved Kanazawa University og University of Tokyo rapporterer i Naturkommunikation visualisering af dynamikken i 'molekylær saks'-hovedmekanismen i genteknologisk teknik CRISPR-Cas9.

En af de teknikker, der anvendes inden for genteknologi-processen med kunstig ændring af genomet for en levende organisme-involverer det såkaldte CRISPR-Cas9-nukleasesystem. Ved hjælp af dette system, en celles DNA kan skæres på et ønsket sted, hvor gener kan slettes eller tilføjes. Valg af stedet, der skal skæres, foretages ved hjælp af et 'guide RNA' -molekyle bundet til Cas9 -proteinet. Nu, et team af forskere ledet af Mikihiro Shibata fra Kanazawa University og Osamu Nureki fra University of Tokyo har visualiseret dynamikken i CRISPR-Cas9-komplekset, især hvordan det skærer DNA, giver værdifuld indsigt i den CRISPR-Cas9-medierede DNA-spaltningsmekanisme.

Til deres visualiseringsstudier, forskerne brugte højhastigheds atomkraftmikroskopi (HS-AFM), en metode til billeddannelse af overflader. En overflade sonderes ved at flytte en lille cantilever hen over den; kraften, som sonden oplever, kan omdannes til et højdemål. En scanning af hele overfladen resulterer derefter i et højdekort over prøven. Den hurtige eksperimentelle opsætning af Shibata og kolleger muliggjorde ekstremt hurtig, gentagne scanninger - konverterbare til film - af biomolekylerne, der deltager i den molekylære sakseaktion.

Først, forskerne sammenlignede Cas9 uden og med RNA vedhæftet (Cas9 – RNA). De fandt ud af, at førstnævnte var i stand til fleksibelt at vedtage forskellige konformationer, mens sidstnævnte har en fast, to-lap struktur, fremhæver konformationsstabiliseringsevnen af ​​guide-RNA'et. Derefter, Shibata og kolleger kiggede på, hvordan det stabiliserede Cas9 -RNA -kompleks retter sig mod DNA. De bekræftede, at det binder sig til et på forhånd udvalgt protospacer-tilstødende motiv (PAM) sted i DNA'et. En PAM er en kort nukleotidsekvens placeret ved siden af ​​DNA'ets målsted, som er komplementær til guide -RNA.

Forskerteamets højhastighedsfilm afslørede yderligere, at målretning ('DNA-forhør') opnås gennem 3-D-diffusion af Cas9-RNA-komplekset. Endelig, det lykkedes forskerne at visualisere dynamikken i selve spaltningsprocessen:de observerede, hvordan regionen 'molekylær saks' undergår konformationsudsving, efter at Cas9 – RNA lokalt afvikler det dobbeltstrengede DNA (film 1 [URL]).

Shibatas arbejde fremmer vores forståelse af genomredigeringsmekanismen CRISPR-Cas9. Med forskernes ord:"... denne undersøgelse giver hidtil usete detaljer om den funktionelle dynamik i CRISPR-Cas9, og fremhæver HS-AFM's potentiale for at belyse virkningsmekanismerne for RNA-styrede effektor-nukleaser fra forskellige CRISPR-Cas-systemer. "

CRISPR-Cas9

CRISPR, kort for "klyngede regelmæssigt mellemrum korte palindromiske gentagelser", refererer til et sæt bakterielle DNA -sekvenser, der indeholder fragmenter af DNA'et fra vira, der tidligere har angrebet bakterierne. Disse fragmenter bruges af bakterierne til at forhindre yderligere angreb af de samme vira. "Cas" refererer til CRISPR-associerede gener; "Cas9" er et CRISPR-associeret protein med to nukleasedomæner (En nuklease er et enzym, der er i stand til at spalte nukleinsyrer, organiske molekyler til stede i DNA og RNA).

I de seneste år, en genteknisk teknik, hvor et CRISPR-Cas9-kompleks fungerer som 'molekylær saks' er blevet udviklet Cas9 -nukleasen binder til et guide -RNA -molekyle, der indeholder information om DNA -stedet, der skal målrettes. Ved hjælp af højhastigheds atomkraftmikroskopi, Mikihiro Shibata fra Kanazawa University og kolleger har nu undersøgt dynamikken i CRISPR-Cas9-komplekset i detaljer.

Atomkraftmikroskopi

Atomic force microscopy (AFM) er en billeddannelsesteknik, hvor billedet dannes ved at scanne en overflade med en meget lille spids. Horizontal scanning motion of the tip is controlled via piezoelectric elements, while vertical motion is converted into a height profile, resulting in a height distribution of the sample's surface. As the technique does not involve lenses, its resolution is not restricted by the so-called diffraction limit. In a high-speed setup, AFM can be used to produce movies of a sample's evolution in real time. High-speed AFM has been used successfully to study protein dynamics, for example myosin V walking on an actin filament, the photo-induced conformational change of bacteriorhodopsin, and the degradation of cellulose. Shibata and colleagues have now applied the high-speed AFM technique for visualizing the dynamics of DNA cleavage by CRISPR-Cas9.