Ny undersøgelse beskriver, hvordan befrugtning udløser ændringer i tusinder af proteiner i frøæg

I mere end et halvt århundrede, undersøgelser af den afrikanske klofrø (Xenopus laevis) har hjulpet forskere med bedre at forstå livets biologiske grundlag, fra embryonisk udvikling og neurobiologi til genetik og sygdom. Frøens påstande om berømmelse omfatter den nobelprisvindende opdagelse, at voksen celleskæbne kan omprogrammeres, og det var engang verdens eneste pålidelige graviditetstest.

Nu, nye teknologier gør det muligt for forskere at lære endnu mere om de grundlæggende processer, der driver biologi fra disse hjemlige modelorganismer.

Rapportering i Procedurer fra National Academy of Sciences , et team ledet af Harvard Medical Schools systembiolog Marc Kirschner beskriver en ny tilgang til at identificere og måle ændringer i tusinder af proteiner, når Xenopus -æg gennemgår befrugtning.

Deres forskning afslører tidligere uigennemsigtige aspekter af de molekylære mekanismer, der er involveret i befrugtning, herunder detaljer om, hvordan befrugtning udløser ødelæggelse af et lille antal lavproteinproteiner for at frigive "bremserne" på et ægs cellecyklus, og hvordan ægget hurtigt frigiver enorme mængder protein for at forhindre befrugtning af flere sædceller.

Resultaterne muliggør omfattende analyser af proteindynamik i en celle inden for et snævert tidsvindue, sagde forskerne, som kan informere undersøgelser af molekylær adfærd i en lang række biologiske systemer og hjælpe med at kaste lys over cellulære ændringer, der driver sygdom.

"Vi har udviklet en metode, der giver os en kritisk vigtig evne til at kvantificere og måle absolutte niveauer af proteiner og proteinmodifikationer i en dynamisk, komplekst system, sagde Kirschner, John Franklin Enders University professor i systembiologi og formand for Institut for Systembiologi ved Harvard Medical School.

"Metoden bør bruges meget i mange biologiske og biomedicinske undersøgelser, "Tilføjede Kirschner.

Xenopusæg har været brugt i årtier til at undersøge de molekylære begivenheder, der opstår under befrugtning, kaster lys over cellens cyklus, celledeling og embryonal udvikling.

Selvom meget er kendt fra mange års studier, forskere har stadig en ufuldstændig forståelse af mange aspekter af befrugtning på grund af tekniske begrænsninger - især et omfattende billede af de involverede proteiner, deres funktioner og hvad der sker med dem over tid.

Stregkodescanning

Med kollegerne Marc Presler og Elizabeth Van Itallie, kandidatstuderende i systembiologi ved Harvard Medical School, og Allon Klein og Steven Gygi, professorer i systembiologi og cellebiologi ved Harvard Medical School, Kirschner og forskergruppen brugte en teknik til at mærke proteiner i Xenopus-æg med stregkode-lignende kemiske mærker, giver forskerne mulighed for at analysere tusindvis af proteiner på én gang ved hjælp af massespektrometri.

Når det kombineres med en ny analytisk metode, denne fremgangsmåde gjorde det muligt for teamet at måle de absolutte proteinniveauer i en celle og afsløre detaljer om et proteins phosphorylering - en af ​​de primære kemiske ændringer, som celler bruger til at regulere aktiviteten af ​​et protein.

Målinger under og op til 20 minutter efter befrugtning, forskerne fandt ud af, at niveauerne af et lille antal lavproteinproteiner hurtigt falder.

Inden for få minutter, ødelæggelsen af ​​disse proteiner forårsager omvendt fosforylering af et meget bredere proteinområde i hele cellen - en proces, der fremmer afslutningen af ​​cellecyklussen, herunder adskillelse af kromosomkopier, som forbereder ægget til yderligere vækst.

Selvom kun omkring 0,01 procent af cellens samlede proteinmasse blev nedbrudt, teamet fandt ud af, at befrugtning også udløser bortvisning af 50 gange denne mængde protein fra cellen. Primært opbevaret i cellelokaler nær membranen, disse sæt proteiner udskilles sandsynligvis for at forhindre befrugtning af flere sædceller, sagde forskerne.

Denne frigivelse falder sammen med en betydelig stigning i phosphorylering for talrige signalproteiner og andre, der spiller en rolle i at generere sammentrækningsbølger på overfladen af ​​ægget umiddelbart efter befrugtning.

Ægget udskiller også flere proteinnedbrydende enzymer uden for cellen, som forskere formoder hjælper med at blokere flere befrugtningsbegivenheder ved at ødelægge sædbindende proteiner. I et lidt paradoksalt fund, teamet observerede også en stigning i proteiner, der hæmmer aktiviteten af ​​proteinnedbrydende enzymer. Grundene, imidlertid, forblive uklare og præsenterer en vej til fremtidige undersøgelser.

"Vi var i stand til at observere både nye og tidligere kendte træk ved cellecyklussen, men vi var også i stand til at fjerne andre store begivenheder, der sker parallelt, "Presler sagde." Befrugtning sker ved koordinering af tusindvis af molekyler på én gang, og for første gang har vi mulighed for at forstå det i denne skala. "

Den nye metode muliggør målinger af de absolutte proteinniveauer og fosforylering gennem en kombination af teknologiske og matematiske tilgange. Det repræsenterer en væsentlig forbedring i forhold til almindeligt anvendte proteinanalyser i stor skala, der kan gøre den nøjagtige forudsigelse af funktionelle forskelle udfordrende.

Ved væsentligt at forbedre detaljer og skala, hvor forskere kan studere proteinsammensætning og modifikationer, selv over smalle vinduer i tiden, teamet mener, at disse teknikker kan anvendes på mange biologiske systemer.

"For at forstå og helbrede sygdom, vi har brug for en mere præcis forståelse af, hvad der sker normalt, sunde processer, "Sagde Presler." Vi spurgte, hvad de molekylære forskelle mellem et befrugtet og ufrugtet æg var, men denne tilgang er umiddelbart anvendelig til at studere andre vigtige spørgsmål, såsom forskellene mellem celler, der er i sunde og sygdomstilstande. "

"Proteinbiokemi driver meget af cellens funktion, og denne metode kan give os et mere komplet billede af, hvordan celler gør, hvad de gør, " han sagde.