Bliver videnskabsmænd narret af bakterier?

I årtier har en lille gruppe banebrydende medicinske forskere studeret et biokemisk DNA-mærkningssystem, som slår gener til eller fra. Mange har studeret det i bakterier, og nu har nogle set tegn på det i planter, fluer og endda menneskelige hjernetumorer. Men ifølge en ny undersøgelse foretaget af forskere ved Icahn School of Medicine ved Sinai-bjerget, kan der være et problem:Meget af beviserne for dets tilstedeværelse i højere organismer kan skyldes bakteriel forurening, som var svær at få øje på ved hjælp af nuværende eksperimentelle metoder.

For at løse dette skabte forskerne en skræddersyet gensekventeringsmetode, som er afhængig af en ny maskinlæringsalgoritme til nøjagtigt at måle kilden og niveauerne af mærket DNA. Dette hjalp dem med at skelne bakterielt DNA fra det fra menneskelige og andre ikke-bakterielle celler. Mens resultaterne er offentliggjort i Science støttede ideen om, at dette system kan forekomme naturligt i ikke-bakterielle celler, niveauerne var meget lavere end nogle tidligere rapporterede undersøgelser og blev let fordrejet af bakteriel kontaminering eller nuværende eksperimentelle metoder. Eksperimenter med humane hjernekræftceller gav lignende resultater.

"At rykke grænserne for medicinsk forskning kan være udfordrende. Nogle gange er ideerne så nye, at vi er nødt til at gentænke de eksperimentelle metoder, vi bruger til at teste dem af," siger Gang Fang, Ph.D., lektor i genetik og genomiske videnskaber ved Icahn Sinai-bjerget. "I denne undersøgelse udviklede vi en ny metode til effektivt at måle dette DNA-mærke i en lang række arter og celletyper. Vi håber, at dette vil hjælpe videnskabsmænd med at afdække de mange roller, disse processer kan spille i evolution og menneskelig sygdom."

Undersøgelsen fokuserede på DNA-adenin-methylering, en biokemisk reaktion, som binder et kemikalie, kaldet en methylgruppe, til et adenin, et af de fire byggestensmolekyler, der bruges til at konstruere lange DNA-strenge og kode for gener. Dette kan "epigenetisk" aktivere eller dæmpe gener uden faktisk at ændre DNA-sekvenser. For eksempel er det kendt, at adenin-methylering spiller en afgørende rolle i, hvordan nogle bakterier forsvarer sig mod vira.

I årtier troede forskerne, at adenin-methylering strengt taget fandt sted i bakterier, mens menneskelige og andre ikke-bakterielle celler var afhængige af methyleringen af ​​en anden byggesten - cytosin - for at regulere gener. Siden omkring 2015 ændrede denne opfattelse sig. Forskere opdagede høje niveauer af adenin-methylering i plante-, flue-, mus- og menneskeceller, hvilket tyder på en bredere rolle for reaktionen gennem hele evolutionen.

Men de videnskabsmænd, der udførte disse indledende eksperimenter, stod over for vanskelige afvejninger. Nogle brugte teknikker, der præcist kan måle adenin-methyleringsniveauer fra enhver celletype, men som ikke har kapacitet til at identificere, hvilken celle hvert stykke DNA kom fra, mens andre stolede på metoder, der kan spotte methylering i forskellige celletyper, men som kan overvurdere reaktionsniveauer.

I denne undersøgelse udviklede Dr. Fangs team en metode kaldet 6mASCOPE, som overvinder disse afvejninger. Heri udvindes DNA fra en prøve af væv eller celler og hakkes op i korte tråde af proteiner kaldet enzymer. Strengene placeres i mikroskopiske brønde og behandles med enzymer, der laver nye kopier af hver streng. En avanceret sekventeringsmaskine måler derefter i realtid den hastighed, hvormed hver nukleotid-byggeblok tilføjes til en ny streng. Methylerede adeniner forsinker en smule denne proces. Resultaterne føres derefter ind i en maskinlæringsalgoritme, som forskerne trænede til at estimere methyleringsniveauer ud fra sekventeringsdataene.

"Dna-sekvenserne gjorde det muligt for os at identificere, hvilke celler - menneskelige eller bakterielle - methylering fandt sted i, mens maskinlæringsmodellen kvantificerede niveauerne af methylering i hver art separat," sagde Dr. Fang,

Indledende eksperimenter på simple, enkeltcellede organismer, såsom grønne alger, antydede, at 6mASCOPE-metoden var effektiv, idet den kunne påvise forskelle mellem to organismer, der begge havde høje niveauer af adenin-methylering.

Metoden så også ud til at være effektiv til at kvantificere adenin-methylering i komplekse organismer. For eksempel havde tidligere undersøgelser antydet, at høje niveauer af methylering kan spille en rolle i den tidlige vækst af frugtfluen Drosophila melanogaster og af det blomstrende ukrudt Arabidopsis thaliana . I denne undersøgelse fandt forskerne ud af, at disse høje niveauer af methylering for det meste var resultatet af forurening af bakterielt DNA. I virkeligheden havde fluen og plante-DNA fra disse eksperimenter kun spormængder af methylering.

Ligeledes antydede eksperimenter på humane celler, at methylering forekommer ved meget lave niveauer i både sunde og sygdomstilstande. Immuncelle-DNA opnået fra patientblodprøver havde kun spormængder af methylering.

Lignende resultater blev også set med DNA isoleret fra glioblastom hjernetumorprøver. Dette resultat var anderledes end en tidligere undersøgelse, som rapporterede meget højere niveauer af adenin-methylering i tumorceller. Men som forfatterne bemærker, kan der være behov for mere forskning for at bestemme, hvor meget af denne uoverensstemmelse, der kan skyldes forskelle i tumorundertyper såvel som andre potentielle kilder til methylering.

Endelig fandt forskerne ud af, at plasmid-DNA, et værktøj, som forskere regelmæssigt bruger til at manipulere gener, kan være forurenet med høje niveauer af methylering, der stammer fra bakterier, hvilket tyder på, at dette DNA kan være en kilde til kontaminering i fremtidige eksperimenter.

"Vores resultater viser, at måden, hvorpå adenin-methylering måles, kan have dybtgående virkninger på resultatet af et eksperiment. Vi mener ikke at udelukke muligheden for, at nogle humane væv eller sygdomsundertyper kan have meget rigelig DNA-adenin-methylering, men vi gør det. håber 6mASCOPE vil hjælpe videnskabsmænd med at undersøge dette problem fuldt ud ved at udelukke skævheden fra bakteriel kontaminering," sagde Dr. Gang. "For at hjælpe med dette har vi gjort 6mASCOPE analysesoftwaren og en detaljeret betjeningsvejledning bredt tilgængelige for andre forskere."