En lille faktor har stor indflydelse på genomredigering

Gennem mange års konstruktion af genredigeringssystemer har forskere udviklet en række værktøjer, der muliggør modifikation af genomer i levende celler, beslægtet med "genomkirurgi." Disse værktøjer, inklusive dem, der er baseret på et naturligt system kendt som CRISPR/Cas9, tilbyder et enormt potentiale til at imødekomme udækkede kliniske behov, understreget af den nylige FDA-godkendelse af den første CRISPR/Cas9-baserede behandling.

En relativt ny tilgang kaldet "prime editing" muliggør genredigering med enestående nøjagtighed og høj alsidighed, men har en kritisk afvejning:variabel og ofte lav effektivitet i redigeringsinstallationen. Med andre ord, mens prime-redigeringer kan udføres med høj præcision og få uønskede biprodukter, mislykkes fremgangsmåden også ofte i at foretage disse redigeringer med rimelige frekvenser.

I et papir, der udkom på tryk i tidsskriftet Nature den 18. april 2024 beskriver Princeton-forskerne Jun Yan og Britt Adamson sammen med flere kolleger en mere effektiv hovedredaktør.

Prime-redigeringssystemer består minimalt af to komponenter:en modificeret version af proteinelementet i CRISPR/Cas9 og et ribonukleinsyre (RNA) molekyle kaldet et pegRNA. Disse komponenter arbejder sammen i flere koordinerede trin:For det første binder pegRNA'et proteinet og leder det resulterende kompleks til en ønsket placering i genomet.

Der klipper proteinet DNA'et og ved hjælp af en skabelonsekvens kodet på pegRNA'et, "omvendt transkriberer" en redigering ind i genomet i nærheden. På denne måde "skriver" primære redaktører nøjagtige sekvenser ind i målrettet DNA.

"Prime-redigering er et så utroligt kraftfuldt genomredigeringsværktøj, fordi det giver os mere kontrol over præcis, hvordan genomiske sekvenser ændres," sagde Adamson.

I begyndelsen af ​​deres undersøgelse ræsonnerede Adamson og Yan, en kandidatstuderende i Adamsons forskningsgruppe og Institut for Molekylær Biologi, at ukendte cellulære processer kan hjælpe eller hindre prime-redigering. For at identificere sådanne processer lagde Yan en konceptuelt simpel plan:For det første ville han konstruere en cellelinje, der ville udsende grøn fluorescens, når visse prime-redigeringer blev installeret. Derefter ville han systematisk blokere ekspression af proteiner, der normalt udtrykkes i disse celler, og måle redigeringsinduceret fluorescens for at bestemme, hvilke af disse proteiner der påvirker prime-redigering.

Ved at udføre denne plan identificerede holdet 36 cellulære determinanter for prime-redigering, hvoraf kun én – det lille RNA-bindende protein La – fremmede redigering.

"Selvom promovering af prime-redigering naturligvis ikke er en normal funktion af La-proteinet, viste vores eksperimenter, at det stærkt kan lette processen," sagde Yan.

I celler er La kendt for at binde specifikke sekvenser, der ofte findes i enderne af små RNA-molekyler, og det beskytter disse RNA'er mod nedbrydning. Princeton-holdet erkendte med det samme, at de pegRNA'er, der blev implementeret i Yans første eksperimenter, sandsynligvis indeholdt de nøjagtige sekvenser, kaldet polyuridin-kanaler, da de er et typisk, men ofte overset biprodukt af pegRNA-ekspression i celler. Efterfølgende eksperimenter antydede, at sådanne pegRNA'er utilsigtet udnytter La's endebindende aktivitet til beskyttelse og for at fremme prime redigering.

Motiveret af deres resultater spurgte holdet, om sammensmeltning af den del af La, der binder polyuridinkanaler til et standard prime-redigeringsprotein, kunne øge prime-redigeringseffektiviteten. De var begejstrede over at opdage, at det resulterende protein, som de kalder PE7, væsentligt forbedrede den tilsigtede prime-redigeringseffektivitet på tværs af betingelser og, når de brugte nogle prime-redigeringssystemer, efterlod frekvenserne af uønskede biprodukter meget lave.

Deres resultater tiltrak hurtigt opmærksomheden hos kolleger, der var interesserede i at bruge prime-redigering i primære humane celler, herunder Daniel Bauer ved Boston Children's Hospital og Harvard Medical School og Alexander Marson ved University of California, San Francisco. Sammen med forskere fra disse laboratorier fortsatte forskerholdet med at demonstrere, at PE7 også kan forbedre den bedste redigeringseffektivitet i terapeutisk relevante celletyper, hvilket giver et udvidet løfte for fremtidige kliniske anvendelser.

"Dette arbejde er et smukt eksempel på, hvordan dyb undersøgelse af cellers indre funktion kan føre til uventet indsigt, der kan give en biomedicinsk effekt på kort sigt," bemærkede Bauer.

Flere oplysninger: Jun Yan et al., Forbedring af prime redigering med et endogent lille RNA-bindende protein, Nature (2024). DOI:10.1038/s41586-024-07259-6

Journaloplysninger: Natur

Leveret af Princeton University