Biomolekylære kondensater:Undersøgelse afslører dårlig forudsigelsesevne af etablerede væske-væskefaseseparationsassays

Celler summer af millioner af forskellige biomolekyler, der diffunderer kaotisk gennem deres understrukturer, men alligevel formår de at sikre udsøgt funktionel og rumlig specificitet.

Distinkte biomolekyler interagerer specifikt i cellulære processer og fører til målrettede cellulære responser. Dette opnås ofte ved at lede biomolekyler til subcellulære rum. Rum som mitokondrier er rumligt adskilt af membraner. Andre, som nukleoler, har slet ingen membrangrænser.

Hvordan disse membranløse rum dannes er stadig et af de største mysterier i biologi. I de senere år er et fænomen kaldet væske-væskefaseseparation (LLPS) blevet foreslået som drivkraften for rumsamling.

Gruppen af ​​Andrea Musacchio, direktør ved Max Planck Institute of Molecular Physiology, har nu udviklet en valideringsstrategi for at evaluere LLPS's rolle i kompartmentdannelse og til at vurdere almindelige metoder til påvisning af LLPS-egenskaber. Studiet er publiceret i tidsskriftet Molecular Cell .

Anvendelse af strategien på processen med centromersamling under celledeling, som blev foreslået at blive drevet af et LLPS-stillads (kromosompassagerkomplekset eller CPC), kunne ikke identificere LLPS som en afgørende drivkraft, hvilket bekræfter den lave forudsigelsesevne af disse assays. . Denne nye strategi har potentialet til at blive et vigtigt værktøj til at validere rollen for andre potentielle LLPS-drivere, der er identificeret indtil videre.

Proteiner, som opfylder de fleste af funktionerne i vores krop ved at interagere med andre proteiner, står over for et dilemma – de bevæger sig rundt i cellen med 40 millioner potentielle interaktionspartnere.

At finde den rigtige partner kan derfor virke som at søge efter en nål i en høstak. Ikke desto mindre, hvis sandsynligheden for, at et protein møder den rigtige partner på det rigtige tidspunkt tilfældigt kan virke lav - har cellen fundet en strategi til at bringe proteiner sammen, der ligner at møde en potentiel partner på arbejdet, på en café eller i klubben:Rumlig signaler leder proteiner til definerede cellekompartmenter, såsom plasmamembranen eller mitokondriet.

Processen med celledeling, for eksempel, initieres af signaleringsprocesser ved cellemembranen, som aktiverer enzymer, hvis signaler i sidste ende når cellekernen for at udløse målrettet gentransskription.

Under den efterfølgende celledeling fører et væld af specifikke proteininteraktioner til dannelsen af ​​et flerlagsproteinkompleks ved kromosomernes centromerer, som sikrer fejlfri fordeling af kromosomerne i en modercelle til dens to døtre.

Naturen har udviklet en bestemt kemi for interagerende proteiner:Proteiner beregnet til hinanden er udstyret med evolutionært bevarede og eksponerede grænseflader med detaljerede kemiske identiteter i deres 3D-struktur, som er komplementære til hinanden. Disse motiver findes på tværs af arter og muliggør meget specifikke proteininteraktioner.

Et paradigmeskifte?

Ved begyndelsen af ​​forrige århundrede blev de første cellulære rum, der ikke var afgrænset af fysiske grænser, først observeret. Vi ved nu, at nukleoler, P-legemer eller stressgranulat koncentrerer makromolekyler, hovedsageligt proteiner og RNA, og har vigtige funktioner i cellen.

Opdagelsen af ​​disse membranløse rum har åbnet et nyt forskningsfelt fuld af ubesvarede spørgsmål, hvoraf den mest udfordrende er, hvordan disse rum er dannet, og hvordan de bevarer deres struktur.

I de senere år har ideen om, at disse rum dannes ved en proces kaldet væske-væske-afblanding eller væske-væske-faseseparation, der kan sammenlignes med den spontane dannelse af oliedråber i vand, taget betydeligt fart.

Ifølge denne opfattelse er membranløse rum "kondensater", hvis dannelse er baseret på forbigående, svage og uspecifikke interaktioner af "driver"-proteiner, hvilket i sidste ende forårsager deres akkumulering der ved en koncentration, der er højere end i det omgivende medium.

Assays, der undersøger faseadskillelsesegenskaber af proteiner uden for cellen, har identificeret dusinvis af disse drivkræfter til dato, inklusive det kromosomale passagerkompleks (CPC), som er blevet hævdet at danne kondensater ved centromeren for at modulere dets organisation og funktion under mitose.

In vitro er ikke in vivo:Du kan ikke negligere cytosolen

"For mange forskere er faseadskillelse blevet standardforklaringen på dannelsen af ​​membranløse rum. Der er dog meget få beviser for, at LLPS-assays udført in vitro virkelig kan forudsige en fysiologisk proces i cellens miljø," siger Musacchio.

Sammen med sit team har han udviklet en strategi til at evaluere et udbredt LLPS-assay og dets forudsigelsesevne og anvendt det til CPC.

"Efter vores mening er en stor svaghed ved assayene, at det ikke modellerer opløsningsmidlet med tilstrækkelig nøjagtighed. Opløsningsmidlet definerer et proteins opløselighed og dermed dets evne til at interagere med andre proteiner."

For at efterligne cellens naturlige miljø så tæt som muligt tilføjede videnskabsmanden fortyndede bakterielle eller pattedyrcellelysater til standard LLPS-buffere. Selv ved stærkt fortyndede koncentrationer forhindrede lysater fuldstændigt dannelsen af ​​kondensater. For at vurdere, hvor generelt dette var, gentog forskerne det samme eksperiment med flere yderligere proteiner, som alle viste LLPS-egenskaber i standardassayet. Og faktisk i alle tilfælde opløste tilsætning af cellelysater "kondensaterne."

"Disse resultater bekræfter vores antagelse om, at det cellulære miljø effektivt buffer de uspecifikke svage interaktioner, der menes at forårsage LLPS in vitro", siger Musacchio.

Dårlig forudsigelsesevne

Interaktioner og funktioner af proteiner i cellen er stærkt reguleret af såkaldte post-translationelle modifikationer. Målrettet tilsætning eller fjernelse af fosfatgrupper på kritiske steder kan for eksempel forstyrre interaktionen mellem to proteiner med øjeblikkelig virkning. Disse naturlige modifikationer kan efterlignes i laboratoriet ved mutationer og er den foretrukne metode, når det kommer til at undersøge mange cellulære processer.

Ved at introducere mutationer ved fire rester involveret i genkendelsen af ​​phosphorylerede signaler, genererede videnskabsmanden en mutant af CPC, som ikke kan rekrutteres til centromerer og ikke akkumuleres der. Ikke desto mindre viste denne mutant stadig fuldt LLPS-potentiale i in vitro-assayet, hvilket viser, at assayet ikke er i stand til at forudsige CPC-lokalisering og funktion.

"Vores resultater viser, at LLPS af en enkelt komponent in vitro ikke kan forudsige opløselighed og lokalisering i cellens komplekse og overfyldte miljø. Listen over formodede LLPS-stilladser identificeret gennem de etablerede assays vil have behov for omfattende genundersøgelse, og valideringsstrategien vi præsenterer her, kan guide denne indsats," siger Musacchio.

"I fremtiden planlægger vi at gentage vores forsøg med mange formodede LLPS-stilladser, især dem, der er blevet flagskibe i væksten af ​​LLPS-feltet. Vores forsøg viser, at cytosolen er et potent opløsningsmiddel, hvis rolle ikke kan negligeres. Derfor er det vil være vigtigt at generere passende cytomimetiske medier som standarder for vurdering af biokemiske reaktioner in vitro. Vi vil forsøge at bidrage til dette forskningsområde."

Flere oplysninger: Marius Hedtfeld et al, En valideringsstrategi til at vurdere rollen af ​​faseadskillelse som en determinant for makromolekylær lokalisering, Molecular Cell (2024). DOI:10.1016/j.molcel.2024.03.022

Journaloplysninger: Molekylær celle

Leveret af Max Planck Society