Hvordan gelelektroforese visualiserer DNA:En praktisk vejledning

Af Andy Pasquesi | Opdateret 24. marts 2022

CMB/Moment/GettyImages

Gelelektroforese er en hjørnestensteknik inden for molekylærbiologi, der adskiller DNA-fragmenter efter størrelse og afslører dem til analyse. Ved at indlejre DNA-prøver i en agarosegelmatrix og påføre et elektrisk felt migrerer de negativt ladede strenge mod anoden, hvor kortere fragmenter rejser hurtigere end længere.

Visualisering med ethidiumbromid

Ethidiumbromid (EtBr) inkorporeres i agaroseblandingen (agarosepulver, EDTA-buffer, vand). Når først gelen polymeriserer, er EtBr jævnt fordelt gennem matrixen. Efter påfyldning af DNA-prøver og sporing af farvestoffer i brøndene, udsættes gelen for en kontrolleret spænding, der trækker DNA'et gennem porerne.

Når strengene bevæger sig, interkalerer EtBr mellem basepar, binder midlertidigt til DNA'et og fører fluorescenssignalet med. Ved slutningen af ​​kørslen har hvert fragment absorberet en betydelig mængde EtBr. Belysning af gelen med en UV-transilluminator exciterer det bundne farvestof, hvilket får DNA-båndene til at gløde. Et kalibreret kamera tager billedet til dokumentation.

Alternativ farvning med methylenblåt

Når en UV-transilluminator ikke er tilgængelig, kan gelen farves med methylenblåt. Efter elektroforese, iblødsætning af gelen natten over i en methylenblå opløsning tillader farvestoffet at trænge ind i matrixen og binde til DNA'et via hydrogenbinding. Den resulterende blå farve er synlig med det blotte øje, hvilket giver et simpelt, billigt alternativ til fluorescens.

Sporingsfarvestoffer til størrelsesestimering

Sporingsfarvestoffer - såsom bromphenolblåt og xylencyanol - tilsættes til loadingbufferen for at overvåge fremskridt uden at forstyrre DNA-migrering. Bromphenolblåt bevæger sig med en hastighed svarende til ~300 nukleotider, mens xylencyanol matcher ~4.000 nukleotider. Ved at sammenligne et DNA-bånds position med disse markører kan teknikere estimere fragmentstørrelsen i basepar.

Sammenfattende muliggør gelelektroforese kombineret med passende farvnings- og sporingsfarvestoffer præcis visualisering og dimensionering af DNA-fragmenter, hvilket danner grundlaget for utallige genetiske analyser.