En RNA-BEHANDLING til Halloween

Jeff Chao, Juniorgruppeleder ved FMI, og hans gruppe udviklede en sofistikeret metode til at måle mRNA-nedbrydning i enkeltceller. De udviklede en fluorescerende biosensor, der gør det muligt at skelne mellem intakte transkripter og nedbrydningsmellemprodukter. Denne nye metode, kendt som TREAT, supplerer fint den metode, de udviklede tidligere, kaldet TRICK, der måler proteinoversættelse.

Et RNAs liv starter i kernen, hvor det er syntetiseret og yderligere modificeret - begrænset, splejset og polyadenyleret. Det bevæger sig derefter ind i cytoplasmaet, hvor det oversættes til et protein, og til sidst forringet. Mængden af ​​produceret protein afhænger i høj grad af reguleringen af ​​transkription, men også overfloden af ​​mRNA. Som FMI-gruppeleder, Jeff Chao påpeger, "Det er blevet mere og mere klart, at reguleringen af ​​mRNA-nedbrydning, især under udvikling eller hurtige miljøændringer, kan dramatisk påvirke RNA-niveauer." Mens mange af RNA-nedbrydningstrinene er blevet karakteriseret, en klar forståelse af, hvornår og hvor nedbrydning sker, har hidtil manglet.

Jeff Chao og hans team har nu udviklet en fluorescerende mikroskopimetode, der giver dem mulighed for at måle den rumlige og tidsmæssige dynamik i nedbrydningen af ​​enkelte mRNA -molekyler i levende celler.

Chao og hans kolleger udnyttede en viral RNA-struktur, der danner en knudelignende struktur. Denne pseudo-knude forhindrer nedbrydning af mRNA af Xrn1, en 5'-3 'exoribonuclease. Chao forklarer:"Ved hjælp af en flerfarvet biosensor, der indeholder disse virale pseudo-knuder, vi var i stand til at skelne mellem intakte mRNA-transkripter og mRNA-transkripter, der er ved at blive nedbrudt." Forskerne kaldte denne teknik for TREAT for 3(Three)'-RNA-endeakkumulation under omsætning.

Først og vigtigst, TREAT gjorde det muligt for videnskabsmanden at observere mRNA-nedbrydning i realtid i levende celler. For at visualisere nedbrydning, forskerne konstruerede et transkript, der er mærket med to RNA-bindende proteiner fusioneret til to forskellige fluorescerende tags:et af proteinerne - PP7 (mærket med grønt fluorescerende protein) - binder til den kodende region af mRNA'et, mens den anden – MS2 (med en rød tag) – binder til den 3' utranslaterede region. Mellem PP7 og MS2, forskerne introducerede de virale pseudo-knuder. Således mærket, de individuelle utranslaterede mRNA'er fremstår gule. Da RNA'et nedbrydes af XRN1, den grønmærkede PP7 forskydes. Imidlertid, på positionen af ​​pseudo-knuden, XRN1-nedbrydning stopper, som gør det muligt at detektere en kvantificerbar farveændring fra gul til rød.

Ud over, Chao kommenterer:"Ved at bruge TREAT, vi har været i stand til at måle mRNA-henfald i enkelte celler og fundet ud af, at individuelle nedbrydningsbegivenheder forekommer uafhængigt i cytosolen. De nedbrudte mRNA'er akkumulerede ikke i bearbejdningslegemer." Disse er vigtige første indsigter, fordi bearbejdningslegemerne blev anset for at spille en direkte rolle i RNA-nedbrydning. Bearbejdningslegemer er membranløse rum, der dannes under faseovergange. De består af RNA- bindende proteiner og mRNA'er, og da de indeholder mange proteiner involveret i mRNA-omsætning, det blev foreslået, at de er cellulære steder for RNA-nedbrydning.

"TREAT komplementerer fint den anden teknologi, som vi tidligere udviklede kaldet TRICK. Med valget af passende fluorescerende markører, vi kan nu overvåge både RNA-omsætning og RNA-oversættelse 'live', og vi kan behandle, hvordan disse processer er indbyrdes forbundet i en enkelt celle, " siger Chao.