Sådan foldes et lineært kromosom af Streptomyces

Lineære kromosomer findes kun i nogle Actinomycetes. Streptomyces er en Gram-positiv bakterie med et højt GC-indhold. Det har et lineært kromosom, der varierer fra 6 til 10 Mb i størrelse, og flere cirkulære plasmider med en samlet størrelse på 1-10 % af det kromosomale DNA. Streptomycetes udviser en kompleks livscyklus, der involverer aseksuelle og seksuelle vækstfaser og er kendt for deres omfattende produktion af kemisk forskellige bioaktive sekundære metabolitter.

Det er nødvendigt at linearisere kromosomet for at få individuelle replikoner opløst i pulsfeltgelen. Replikonerne er adskilt af CHEF på basis af størrelse. Den køres normalt i en længere periode, ofte 20-30 timer, for at få en god opløsning.

Her er trinene til, hvordan man folder et lineært kromosom af Streptomyces:

1. Forbered agarosegelen. Lav en 1% agarosegel i 0,5X TBE-buffer.

2. Indlæs DNA-prøven. Bland DNA-prøven med 6X loading buffer og læg den på agarosegelen.

3. Kør gelen. Kør gelen ved 14°C i 20-30 timer ved 2 V/cm.

4. Visualiser DNA'et. Farv gelen med ethidiumbromid og visualiser DNA'et under UV-lys.

5. Fold kromosomet. Det lineære kromosom af Streptomyces vil fremstå som et enkelt stort bånd på gelen. For at folde kromosomet skal du skære båndet ud af gelen og placere det på et stykke Parafilm.

6. Fold Parafilmen over kromosomet flere gange, indtil den er foldet til en kompakt størrelse.

7. Opbevar kromosomet. Det foldede kromosom kan opbevares ved -20°C eller -80°C.

Bemærk: Sørg for at bære handsker og øjenbeskyttelse, når du arbejder med ethidiumbromid. Ethidiumbromid er mutagen og kræftfremkaldende.